„Turbo rak” – szokujące badanie pokazuje, jak mikroarkusze grafenu przenikają do komórek poprzez spontaniczną penetrację błony!

Polubienie i udostępnienie

Udostępnienia

About
Latest Posts

Joana100

W tym streszczeniu opisano badanie skupiające się na interakcji grafenu i grafenu wielowarstwowego (FLG) z błonami komórkowymi. Ma to kluczowe znaczenie dla rozwoju zastosowań biomedycznych i zapewnienia bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z grafenem. Badania łączą techniki eksperymentalne i symulacje w celu zbadania zachowania materiałów grafenowych w środowiskach biologicznych. Kluczowe wyniki i metody obejmują:

1. Obrazowanie i obserwacje:

Eksperymenty z fluorescencją konfokalną i mikroskopią elektronową wykazały, że grafen wnika do komórek od krawędzi, co prowadzi do całkowitej internalizacji.
Takie zachowanie zaobserwowano dla różnych próbek FLG o wymiarach bocznych w zakresie od 0,5 do 10 µm.

2. Symulacje i bariery energetyczne:

Symulacje dynamiki molekularnej (zarówno gruboziarnistej, jak i na poziomie atomowym) wykazały wysokie bariery energetyczne dla bezpośredniej penetracji arkuszy grafenu w membrany, co sugeruje, że zwykła penetracja membrany jest energetycznie niekorzystna.

3. Mechanizm penetracji:

Szczegółowe symulacje wykazały, że nieregularne krawędzie, narożniki i występy na arkuszach grafenu lokalnie przebijają membranę. Te ostre struktury inicjują proces, w którym membrana rozprzestrzenia się wzdłuż krawędzi warstwy grafenu, omijając barierę energetyczną, która w przeciwnym razie byłaby wysoka.

4. Spójność wychwytu komórek:

Proponowany mechanizm wyjaśnia, w jaki sposób komórki mogą pomieścić duże arkusze grafenu i jest zgodny z wynikami bioobrazowania obserwowanymi w ludzkich keratynocytach, komórkach nabłonka płuc i mysich makrofagach.

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,klik nij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶1_________________1¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶1___111_1111111_1____¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶1_1881188111111111____¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶881188__¶___8111_______¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶8881____1__________________¶¶¶¶¶¶¶¶¶888¶¶¶¶ ¶11188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶881__________818¶¶¶¶¶¶¶¶18¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶81___1¶_1¶¶¶¶¶¶¶¶¶11¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶818¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶18¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8888¶¶¶¶¶¶¶¶81¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶88888¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶81¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶881111111111_11118888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶81¶ ¶¶¶¶¶881881181111118¶¶¶88111111_____8¶¶¶¶¶¶1¶ ¶¶¶¶¶8¶¶¶81111118¶¶¶¶¶81111881111_____1¶¶¶¶1¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶811118¶81111__118111111111___8¶8_¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶1__1888¶¶¶¶¶¶¶8______11181___18¶ ¶¶¶¶¶¶81118¶¶8_____18188881_______11181__888¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8881____________________1118118¶__¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶881_81___________________111181_188_¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶81_1¶8__________________1111881_____¶ ¶¶¶¶¶8111_118______11_________1111888811____¶ ¶¶¶¶¶81111181__18¶8111___1_111111811111_____¶ ¶¶¶¶¶¶8111_8¶¶¶¶¶¶¶8______1111111111111___18¶ ¶¶¶¶¶¶¶81111¶¶¶¶1____________111111111¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶8111¶¶1_______________1111111888¶¶¶8¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶81118¶88¶¶¶8881_____1111111188_18¶_¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶818¶¶8111__1___111111111118¶811188¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8188888¶¶881111181111118¶¶8111188¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶¶¶811111111111188¶¶81111181¶ ¶¶¶¶¶¶8888¶¶¶¶¶8____________188¶¶¶¶8111111_1¶ ¶¶¶¶81111¶¶¶¶¶811_1111___118¶¶¶¶¶¶81111111_¶¶ ¶¶¶811_1¶¶¶¶¶¶¶88888¶¶¶¶8¶¶¶¶¶¶¶¶81111111_8¶¶ ¶81___1¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶88811118__¶¶¶ ¶___8¶¶¶88¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶888881888_¶8_¶ ¶81_¶¶8888¶¶¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶888888888__¶8__¶ ¶¶¶¶1__1¶¶¶888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶888888881___1¶¶¶ ¶¶88¶¶8_81_1¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8¶88881_11¶¶¶88¶ ¶¶1_18¶¶8__¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶88__8¶¶¶¶1_1¶ ¶81_1118¶¶¶__1¶¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ 888888888888888888888888888888888888888888888 8___________________________________________8 8__¶¶¶¶¶_¶¶___¶¶_¶¶¶¶_¶¶__¶¶_¶¶¶¶¶_¶¶___¶¶__8 8__¶¶____¶¶¶_¶¶¶__¶¶__¶¶¶_¶¶_¶¶____¶¶¶_¶¶¶__8 8__¶¶¶¶__¶¶_¶_¶¶__¶¶__¶¶_¶¶¶_¶¶¶¶__¶¶_¶_¶¶__8 8__¶¶____¶¶___¶¶__¶¶__¶¶__¶¶_¶¶____¶¶___¶¶__8 8__¶¶¶¶¶_¶¶___¶¶_¶¶¶¶_¶¶__¶¶_¶¶¶¶¶_¶¶___¶¶__8 8___________________________________________8 888888888888888888888888888888888888888888888 211_1_1____2¶¶¶¶66¶¶¶¶¶¶¶88¶88__¶888¶¶2________126 __________¶¶¶¶¶12¶¶¶¶¶8¶¶¶866¶612¶8¶¶¶6_1_________ 211_1___6¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶866¶¶66¶822¶¶8886681_______ 1111____2¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8688¶¶8_8¶2168¶61126_______ 21___268¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶¶¶68¶6_188__666______ 11__12¶¶¶¶¶¶228¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶68¶2_26¶2_2861____ 1__16¶¶¶¶¶6___¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶61¶¶_¶¶6¶____122__ 1__8¶¶¶¶¶6____6¶¶¶¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶218¶18¶61¶1______1 2186¶¶¶¶2_1____28682¶8¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶_68266¶1_2¶1_____ 6862¶¶¶¶__1_____6___26_16¶8¶¶¶8__¶211612¶8_¶¶81886 ¶88¶¶¶¶81_1____12________________¶¶1_11_6¶_2¶¶2___ 6¶¶¶¶¶¶6__2____1________________2_88_2_1_¶1¶8661__ 1_¶¶¶¶¶2__8______________________1¶22____¶688¶¶12_ _2¶¶¶¶¶8__21_1_11_____________1__¶__11_1_¶81¶¶¶1__ _2¶¶¶¶¶¶1_2621_1________________18___26__2¶2_¶¶___ 28_¶¶¶¶¶1__262_____1_______1_____2___1611_8¶126___ 8__¶¶¶¶¶2_282_______________1____2___62_2__2¶¶6___ __2¶8¶8¶6_6¶¶¶8182______________622__16__12__82___ __¶2_2¶¶¶_6¶¶¶¶¶¶¶¶12__61_2¶¶¶¶¶¶¶¶66_6___¶¶21112_ 1_81__8¶¶__6¶¶268¶¶¶¶61¶¶¶¶¶¶¶2_18¶¶1__1_2¶¶¶2_1_1 8_22__1¶¶1__6¶¶¶¶¶¶¶¶_____¶¶¶¶¶¶¶_1¶____1¶¶¶¶8____ 1_22__1¶¶8____6¶¶¶2__________81___6______¶¶¶¶¶2___ _______¶¶¶2_______________________2______626¶¶6___ _______8¶¶6_______16__________________1__¶¶¶¶8¶81_ _____686¶¶¶¶2___12______________________¶¶¶¶8¶¶¶86 ___2¶¶¶¶8¶¶¶6_____26_______________16___¶¶¶¶¶¶¶¶¶6 86¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶221__2¶881__________22_____¶¶¶¶¶128¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶882_16_____¶¶¶21____1_1¶¶¶¶¶228¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶8¶¶¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶62¶¶¶8___2___¶¶¶¶¶¶86¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8162__6¶¶¶¶¶¶66_______6____¶¶¶¶¶¶66¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶66___88¶88________¶¶____¶¶¶¶¶¶862¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶6¶1____________¶¶¶1___¶¶¶¶¶¶¶¶626¶ ¶¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶¶2¶8¶¶¶2_________2¶81___2¶¶¶¶¶¶¶¶86618 ¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶¶¶2¶¶¶¶8¶¶¶8¶622¶¶¶_____6¶¶¶¶¶8¶¶¶8288¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8¶¶8888¶628¶¶¶¶¶2¶¶6____1¶¶¶¶¶8¶¶¶8¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶6¶¶8¶¶2666866¶¶¶¶¶¶_¶¶¶____6¶¶¶¶¶8¶¶68¶¶8¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶68¶6¶¶668628¶¶¶¶¶¶82¶¶¶¶__1¶¶¶¶¶62¶¶68¶¶88 ¶¶¶¶¶¶¶¶6¶¶¶¶¶¶6666¶¶¶8¶2118¶¶¶¶6_8¶¶¶¶¶128¶6¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶88¶¶862¶¶¶8¶¶2826¶¶¶¶¶¶¶¶66¶¶16¶¶¶¶¶¶¶8 ¶¶¶¶¶¶¶¶8¶¶¶2¶¶¶8¶¶¶28¶¶¶¶_2¶¶¶8¶¶¶22¶¶618¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶82¶¶28¶¶¶¶8_28¶¶¶2__¶881_¶618¶¶12¶¶¶¶¶¶¶¶¶ _________________11888888111 ____________1¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶81 __________8¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8 ________8¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ _______¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶1 ______¶¶¶¶¶¶811111188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ _____¶¶¶8_____________18¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ____¶¶¶1_______________118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ___¶¶¶1_________________18¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8 __8¶¶¶11_______________1188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ _8¶¶¶¶1______________111111888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ 8¶¶¶¶11____________________1118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶1 ¶¶¶¶¶11_____________________118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶1 8¶¶¶¶1___11______1888111111888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8 ¶¶¶¶¶¶8888¶¶8___8¶¶¶888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶1_1¶¶¶1_¶¶¶¶¶¶¶118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶181_8¶81__1¶¶1___1181____1¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶____11____1881__________18¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶__________1111________118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶8_________111________1188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶_____1____111_____11188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶81_1118_1¶¶¶¶____1118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶881___8¶¶¶¶8__1111888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶18888__18888¶¶8111888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶8118881188¶¶¶81__1188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶81___18¶¶881111118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶81____11111118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶1_____1118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶88¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶_1188¶¶¶¶¶¶¶8888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶11111888888811188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶811111118111111888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶81_11111111111__1_1118¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8811___1__111__________18¶¶¶¶¶8¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶811___1_______________1111¶¶¶¶¶88¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶1______________________1111¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶81_______________________1118¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶1________________________118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶81_____________________111118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶8881_________________________118¶¶¶¶¶¶¶¶88 ¶¶111__________________________118¶¶¶¶¶¶88881 ¶81____________________________1188888¶811111 ¶¶1______________________________11888118¶¶¶¶ ¶¶¶81___________________________118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶81111__________________8¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶88111_________18¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Implikacje

Badanie to dostarcza wglądu w to, jak struktura fizyczna grafenu wpływa na jego interakcje z błonami biologicznymi i podkreśla znaczenie struktury krawędzi dla wychwytu komórkowego. Wyniki te mają znaczenie dla rozwoju narzędzi biomedycznych opartych na grafenie i oceny potencjalnych zagrożeń dla zdrowia związanych z narażeniem na grafen.

Grafen to dwuwymiarowy materiał w kształcie płytki, składający się z pojedynczej warstwy sześciokątnie ułożonych atomów węgla i wykazujący wyjątkowe właściwości elektryczne, mechaniczne i termiczne. Struktury dwuwarstwowe, trójwarstwowe, kilkuwarstwowe grafen i struktury wielowarstwowe o grubości <100 nm to blisko spokrewnione nanomateriały, które często powstają w wyniku termicznej eksfoliacji grafitu i często występują w postaci suchej piany podczas przetwarzania, co zwiększa prawdopodobieństwo narażenia. Zwiększone miejsce pracy. W tym artykule tę grupę materiałów nazywamy „nanomateriałami z rodziny grafenów” (GFN).

Wiele GFN ma średnicę aerodynamiczną mniejszą niż 5 μm i dlatego należy do kategorii materiałów potencjalnie wdychanych. Nawet GFN o dużych wymiarach bocznych (> 20 µm) zazwyczaj mieszczą się w zakresie potencjalnie możliwym do wdychania, a w przypadku nich duże wymiary boczne stanowią wyzwanie dla klirensu za pośrednictwem makrofagów, co sugeruje długi czas przebywania w płucach.

Pomiary w miejscu pracy i symulacje laboratoryjne udokumentowały potencjał narażenia człowieka na syntetyczne nanomateriały poprzez wdychanie na wielu etapach procesu produkcyjnego. Oprócz wdychania suchych pianek nanomateriały węglowe mogą unosić się w powietrzu podczas sonikacji cząstek w zawiesinie, a także podczas cięcia lub wiercenia materiałów kompozytowych. Oprócz narażenia zawodowego, GFN można w szczególności wszczepiać lub wstrzykiwać do zastosowań biomedycznych, takich jak biosensory, rusztowania tkankowe, nośniki leków lub terapii genowej, środki przeciwbakteryjne i sondy do bioobrazowania. Duża powierzchnia właściwa grafenu umożliwia biofunkcjonalizację o dużej gęstości lub ładowanie leku oraz skuteczniejsze celowanie w nowotwór. Ponadto grafen może oferować niższą toksyczność i lepszą powtarzalność produkcji niż niektóre inne platformy materiałowe.

Wymiary boczne GFN wahają się w zakresie kilku rzędów wielkości, od 10 nm do> 100 μm (większe niż większość komórek docelowych). Maksymalne wymiary nanomateriału mają kluczowe znaczenie dla wychwytu komórkowego, klirensu nerkowego, transportu przez barierę krew-mózg i wielu innych zjawisk biologicznych. Opracowywane są warstwy na bazie grafenu o małych wymiarach poprzecznych (<100 nm) do zastosowań w dostarczaniu leków i diagnostyce. Zaobserwowano, że te „nanocząstki” przenikają do komórek, a penetrację ich błony badano eksperymentalnie i poprzez symulacje.

Titov i współpracownicy przeprowadzili gruboziarniste symulacje dynamiki molekularnej, aby zbadać interakcję małych nanocząstek grafenu i wielowarstwowego grafenu (FLG) z dwuwarstwą lipidową i opisali stabilne struktury hybrydowe grafen-lipid. Guo i in. zbadali przenikanie małych nanocząstek grafenu przez dwuwarstwy lipidowe i ich wpływ na deforację membrany.

Znacznie mniej wiadomo na temat podstawowych interakcji komórkowych materiałów grafenowych z wymiarami bocznymi wielkości mikronów (mikrowarstwy grafenu), na których skupia się obecny rozwój materiałów grafenowych. Pilna potrzeba opracowania wytycznych dotyczących produkcji bezpiecznej diagnostyki i terapii biomedycznych, a także regulacji narażenia zawodowego i środowiskowego, uzasadnia podjęcie znacznych wysiłków w celu wyjaśnienia mechanizmów interakcji błony komórkowej z nanomateriałami węglowymi, w szczególności z mikroarkuszami grafenowymi.

Poprzednie badania penetracji nanorurek węglowych do błon komórkowych sugerowały, że istnieje krytyczny wymiar strukturalny rzędu grubości dwuwarstwy (około 4 nm). Poniżej tego wymiaru możliwa staje się bezpośrednia penetracja do dwuwarstwy, natomiast powyżej tego progu do wychwytu wymagana jest endocytoza za pośrednictwem receptora. Grafen jest atomowo cienki w jednym wymiarze, ale zazwyczaj duży w dwóch dodatkowych wymiarach. Nasze wstępne prace nad modelowaniem wykazały wysokie bariery energetyczne utrudniające penetrację błony, nawet gdy warstwy jednowarstwowe stykają się z dwuwarstwą lipidową od krawędzi.

Te bariery wejścia okazały się jeszcze większe w przypadku wielowarstwowych materiałów grafenowych, które są szczególnie interesujące w naszym badaniu ze względu na ich wytwarzanie na dużą skalę poprzez złuszczanie. Na wczesnych etapach nie było jasne, jakie rodzaje materiałów grafenowych (z jaką liczbą warstw i jakie wymiary boczne) będą w stanie przeniknąć do komórek i za pomocą jakiego mechanizmu biofizycznego może to nastąpić.

Dlatego przeprowadziliśmy połączone badanie eksperymentalne i obliczeniowe interakcji grafen-membrana, wykorzystując symulacje dynamiki molekularnej i obrazowanie komórek in vitro, ze szczególnym uwzględnieniem geometrii i dynamiki penetracji i wychwytu komórek. W symulacjach wykorzystano podobne metody gruboziarniste, jak w naszym poprzednim badaniu dotyczącym penetracji końcówek nanorurek węglowych i powiązanych materiałów 1D (30), ale wymagały wyższej rozdzielczości przestrzennej ze względu na grubość atomową grafenu.

Badamy atomowe mechanizmy interakcji komórek z wielowarstwowymi mikrowarstwami grafenu, wykorzystując gruboziarniste symulacje dynamiki molekularnej (CGMD) i symulacje dynamiki molekularnej kontrolowanej wszystkimi atomami (SMD). Symulacje CGMD pokazują dynamiczny proces interakcji dwuwarstwy grafenu, natomiast symulacje SMD pozwalają wyznaczyć bariery energetyczne dla początkowej penetracji grafenu. Symulacje SMD przewidują, że wyidealizowane arkusze grafenu o gładkich krawędziach nie mogą przenikać przez dwuwarstwy lipidowe w temperaturze pokojowej ze względu na wysokie bariery energetyczne, nawet jeśli początkowy kontakt odbywa się wyłącznie od krawędzi.

Jednak badanie faktycznie wytworzonych mikrowarstw grafenu ujawnia wysoce nieregularne topografie krawędzi, dlatego opracowaliśmy osobny model teoretyczny interakcji grafenu z dwuwarstwami, który rozpoczyna się w ostrych narożnikach lub występach. Model ten przewiduje, że wychwyt komórek można zainicjować poprzez spontaniczne, lokalne przekłucie membrany w narożnikach lub nierównościach, a następnie spontaniczne rozprzestrzenianie się wzdłuż krawędzi grafenu w celu osiągnięcia całkowitej penetracji.

Te przewidywania nowego modelu zostały potwierdzone za pomocą bioobrazowania fluorescencji konfokalnej i mikroskopii elektronowej. Wykazują one penetrację membrany od krawędzi lub od narożnika, a także całkowitą internalizację szeregu wielowarstwowych mikrowarstw grafenu i trzech typów komórek.

Wyniki i dyskusja – Gruboziarnista dynamika molekularna (CGMD)

Rysunek 1 przedstawia wyniki gruboziarnistych symulacji dynamiki molekularnej (CGMD) dotyczących interakcji grafenu i grafenu wielowarstwowego (FLG) z dwuwarstwami lipidowymi. W pierwszej serii symulacji mały, rombowy, jednowarstwowy płatek grafenu o długości krawędzi 6,4 nm umieszczono w odległości około 4 nm powyżej i równolegle do kwadratowej dwuwarstwowej łaty lipidowej składającej się z 992 cząsteczek lipidów i 67 817 cząsteczek wody w pudełko sześcienne o długości krawędzi 24 nm (ryc. 1A). We wszystkich trzech wymiarach zastosowano okresowe warunki brzegowe.

Pod wpływem wahań termicznych płatek grafenu wykazuje ruchy Browna, w tym szybkie wibracje, rotację i migrację w pobliżu dwuwarstwy. Spontaniczną penetrację dwuwarstwy zaobserwowano, gdy płatek osiągnął konfigurację, w której jeden z jego najostrzejszych narożników był zorientowany prawie prostopadle do membrany (ryc. 1B i C). Penetracja ta jest ułatwiona dzięki atrakcyjnym interakcjom między grafenem a grupami ogonowymi lipidów, ale zachodzi tylko wtedy, gdy czubek penetrującego narożnika styka się z hydrofobowym rdzeniem dwuwarstwy.

W naszych symulacjach CG płatek grafenu może całkowicie przeniknąć błonę lipidową, czemu towarzyszy przechylenie płatka w celu uzyskania maksymalnego pokrycia wnętrzem membrany. Ze względu na małe wymiary płatek grafenu ostatecznie pozostał osadzony w dwuwarstwie w naszej symulacji.

Symulacja rombowego płatka grafenu z dwoma różnymi kątami naroży wykazała, że ortogonalna penetracja najostrzejszego narożnika ma najniższą barierę energetyczną i jest preferowaną drogą wejścia. Płaszczyzny krawędziowe grafenu mają złożony skład chemiczny i zazwyczaj są funkcjonalizowane hydrofilowymi grupami tlenowymi. W pożywkach do hodowli komórkowych zaadsorbowane białka mogą również występować na grafenie, co może zmniejszać pozorną hydrofobowość. Próbki GFN użyte w naszych badaniach bioobrazowania miały stosunki C/O od 10 do 32 zgodnie z rentgenowską spektroskopią fotoelektronów, przy czym atomy tlenu prawdopodobnie były związane z krawędziami i miejscami defektów. Dodatkowo ilość zaadsorbowanych białek pokrywała 3–46% powierzchni GFN, w zależności od warunków i próbki.

Aby zbadać te efekty, przeprowadzono dalsze symulacje CGMD z płatkami grafenu o różnych kształtach i chemii powierzchni (różne funkcjonalizacje narożników/krawędzi oraz właściwości hydrofilowe/hydrofobowe). Wyniki potwierdzają, że małe arkusze grafenu mają tendencję do przedostawania się do komórki poprzez spontaniczną penetrację w ich najostrzejszym hydrofobowym narożniku. Seria obliczeń z różnymi parametrami interakcji między cząsteczkami grafenu i lipidów wykazała również, że tryb wejścia w narożnik jest solidny w szerokim zakresie parametrów dynamiki cząstek rozpraszających.

Nasza analiza pokazuje, że prawie ortogonalna orientacja ostrego narożnika grafenu względem dwuwarstwy minimalizuje swobodną energię interakcji i jest termodynamicznie preferowaną konfiguracją nawet przed rozpoczęciem penetracji.

(A – H) pokazują gruboziarniste symulacje dynamiki molekularnej interakcji między dwuwarstwą lipidową i (A – D) małym płatkiem grafenu oraz (E – H) dużym pięciowarstwowym arkuszem grafenu z naprzemiennym układaniem i chropowatą topografią krawędzi. (A–D): Sekwencje czasowe obrazujące dynamikę oddziaływania małego płatka grafenu z dwuwarstwą lipidową. Płatek grafenu rozpoczyna się od mieszania termicznego, wyrównuje się, a ostry wierzchołek w końcu przenika przez membranę, po czym płatek zostaje całkowicie osadzony (E): Eksperymentalna ilustracja struktury krawędzi grafenu scharakteryzowana na podstawie wcześniej udokumentowanych badań (34-36) i jako odniesienie. do symulacji wykorzystuje się (F – H): Sekwencje czasowe dla dużej płyty grafenowej z wieloma warstwami.

Symulacja pokazuje, że szorstkie i naprzemienne krawędzie reprezentują preferowane miejsce interakcji z błoną lipidową. Ostry występ rozpoczyna proces penetracji, który ostatecznie prowadzi do internalizacji. (I) pokazuje znormalizowaną energię swobodną układu jako funkcję orientacji wykresu. Tutaj jeden z najostrzejszych punktów narożnych został umieszczony w stałej odległości 0,5 nm nad dwuwarstwą. Krajobraz energetyczny pokazuje, że orientacja grafenu jest energetycznie uprzywilejowana, a jego orientacja jest prawie ortogonalna w stosunku do membrany, co ułatwia penetrację. Wyniki te podkreślają kluczową rolę topografii krawędzi i narożników w interakcji materiałów grafenowych z błonami lipidowymi i dostarczają wglądu w mechanizmy fizykochemiczne kontrolujące penetrację.

Przeprowadziliśmy także symulacje CGMD dużych arkuszy grafenu z kilkoma warstwami oddziałującymi z dwuwarstwami lipidowymi (ryc. 1 FH). Najpierw zbadaliśmy idealną, atomowo gładką, nieskończoną krawędź grafenu oddziałującą z dwuwarstwami lipidowymi, ale nie zaobserwowaliśmy penetracji. Odkryliśmy, że krawędzie eksperymentalnie przygotowanego grafenu wykazują chropowatość na poziomie atomowym (ryc. 1E), co widać w skaningowej mikroskopii tunelowej z rozdzielczością atomową, a większość arkuszy grafenu składających się tylko z kilku warstw również ma bardzo szorstkie krawędzie (patrz ryc. 4). jak również tarasowe lub skośne struktury krawędziowe, które stają się coraz cieńsze w kierunku jednej z dwóch stron. Rysunek 1F przedstawia model tarasowej struktury krawędziowej utworzonej na pięciowarstwowym płatku FLG oddziałującym z dwuwarstwą.

System symulacyjny składa się z płata dwuwarstwy zawierającego 2016 cząsteczek lipidów i 133 052 cząsteczek wody w sześciennym pudełku o wymiarach 24 nm × 48 nm × 24 nm FLG w kształcie płytki, którego topografia z postrzępionymi krawędziami naśladuje obserwowane topografie w doświadczeniach składa się z pięciu warstw atomowych o odległości równowagowej między warstwami 0,34 nm, początkowo w odległości około 3 nm powyżej i prostopadle do warstwy podwójnej. Każdej warstwie grafenu przypisany jest inny kolor. Dwie pierwsze i dwie ostatnie warstwy ułożone są symetrycznie do warstwy środkowej.

Aby imitować część znacznie większej struktury, dla której ruchy Browna są ograniczone, górna część FLG jest zaciśnięta, a we wszystkich trzech wymiarach pudełka symulacyjnego ustalane są okresowe warunki brzegowe. Dwuwarstwa lipidowa podlega ruchom Browna przez 2,19 μs w pobliżu dużej krawędzi grafenu, która jest ograniczona potencjałem harmonicznym. Ten ostatni jest następnie usuwany, a dwuwarstwowa membrana wchodzi w interakcję z postrzępioną krawędzią grafenu. Pokazano, że FLG penetruje dwuwarstwę pomimo jej wielkości, początkowo lokalizując swoją penetrację w ostrych występach wzdłuż krawędzi. Przebita część membrany następnie rozprzestrzenia się wzdłuż całej krawędzi, powodując całkowitą penetrację.

W tym procesie bariera energetyczna uniemożliwiająca penetrację zostaje pokonana poprzez lokalne przekłucie w ostrych narożnikach wzdłuż nominalnie płaskiej krawędzi, a pełna penetracja jest napędzana przez atrakcyjne oddziaływanie pomiędzy grafenem i grupami ogonów lipidowych po pomyślnym początkowym przekłuciu. Przetestowaliśmy niezawodność tego trybu wejścia, wykonując dalsze symulacje CGMD na jedno- lub wielowarstwowych płatkach grafenu z izolowanym występem lub tarasem lub inicjując kontakt w pobliżu narożnika lub lokalnie złożonej krawędzi.

Wszystkie wyniki symulacji pokazują podobne ścieżki inicjowane przez lokalne przebicie atomowo cienkiej warstwy grafenu, wymagające jedynie energii cieplnej do pokonania małej bariery, po czym następuje rozprzestrzenianie się i pełna penetracja napędzana siłami hydrofobowymi pomiędzy grafenem a rdzeniem dwuwarstwowym. Uważamy, że ten mechanizm wejścia może być ogólnie ważny w przypadku wychwytu komórkowego wszystkich hydrofobowych nanomateriałów 2D o grubości atomowej.

Znaczenie lokalnego przebijania narożników w inicjowaniu wejścia można również wykazać, przeprowadzając symulacje na idealnych, atomowo gładkich, nieskończonych krawędziach grafenu bez nieregularnych cech obserwowanych w rzeczywistych próbkach. W tym przypadku nasze symulacje pokazują, że dwuwarstwa lipidowa jest odpychana od krawędzi grafenu w wyniku połączenia silnej bariery energetycznej wejścia i oddziaływań entropicznych pomiędzy dwuwarstwą a atomowo gładką krawędzią grafenu.

Tę końcową symulację przeprowadzono w celu dalszego wykazania znaczenia lokalnej penetracji jako zdarzenia wyzwalającego, ale nie odpowiada ona żadnemu znanemu biologicznemu scenariuszowi narażenia, ponieważ wymagałaby kontaktu komórek z jednolitą, atomowo gładką, ułożoną poziomo strukturą o długich krawędziach grafenu, co w praktyce jest jedynie trudne do osiągnięcia.

Nasze symulacje pokazują lokalne ortogonalne przekłucie w ostrym narożniku lub guzku, które inicjuje przenikanie grafenu do dwuwarstw lipidowych. Aby lepiej zrozumieć to zachowanie, używamy techniki całkowania termodynamicznego do obliczenia energii swobodnej układu jako funkcji dwóch kątów orientacji rombowego płatka grafenu, gdy jeden z ostrych rogów płatka znajduje się w odległości 0,4 nm powyżej dwuwarstwa jest stała. Kąt pomiędzy długą ukośną osią płatka a warstwą podwójną mieści się w płaszczyźnie grafenu, a kąt pomiędzy wektorami jest normalny do płaszczyzny grafenu i płaszczyzny membrany (rys. 1I). Energia swobodna związana z przebijaniem narożników ortogonalnych jest ustawiona na 0 jako wartość odniesienia.

Nic dziwnego, że orientacja odpowiadająca płatkowi grafenu równoległa do płaszczyzny dwuwarstwy ma najwyższą energię swobodną, ponieważ w tej konfiguracji narzuca najsilniejsze ograniczenie ruchu termicznego. Znormalizowaliśmy obliczoną energię swobodną z jej wartością szczytową w konfiguracji równoległej. Wykreślona znormalizowana energia swobodna na rys. 1I pokazuje, że orientacja ortogonalna ma najniższą energię swobodną, ponieważ w najmniejszym stopniu ogranicza ruchy termiczne membrany i grafenu (a tym samym maksymalizuje entropię układu).

Symulacje dla wszystkich atomów

Nasze symulacje CGMD sugerują, że zlokalizowane przebijanie narożników odgrywa kluczową rolę w początkowej fazie pobierania grafenu przez komórki. Aby określić ewolucję energii związaną z takimi zdarzeniami początkowej penetracji, przeprowadza się dalsze symulacje na całkowicie atomowym modelu penetracji narożników jednowarstwowego płatka grafenu przez dwuwarstwową łatę 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3 -lipid fosfocholiny (POPC) przenoszony w pudełku z cząsteczkami wody. Symulacje obejmujące wszystkie atomy dzielą się na dwa typy. Symulacje typu I mają na celu sprawdzenie, czy istnieje dodatnia siła napędowa penetracji w symulacji MD obejmującej wszystkie atomy.

Jak pokazano na rysunku 2A, zaobserwowano, że trójkątna płytka grafenu umieszczona początkowo w poprzek dwuwarstwy w konfiguracji penetrującej narożniki spontanicznie przemieszczała się w dół i wnikała dalej w dwuwarstwę. W symulacjach typu II barierę energetyczną związaną z przebijaniem narożników oblicza się za pomocą symulacji SMD, w których róg grafenu jest rozciągany przez dwuwarstwę za pomocą wirtualnej sprężyny. Rysunek 2B przedstawia energię interakcji dwuwarstwy grafenu obliczoną na podstawie symulacji SMD w funkcji odległości wzajemnego przenikania.

Obliczenia SMD potwierdzają, że bariera energetyczna jest mała, tylko ∼ 5 kBT, aby róg grafenu przebił górny hydrofilowy obszar głowy dwuwarstwy. Krótko po tym momencie całkowita energia interakcji zaczyna spadać ze względu na korzystne interakcje pomiędzy ogonami lipidowymi w rdzeniu dwuwarstwy a stale rosnącym obszarem zanurzonego grafenu. Zarówno nasze symulacje CGMD, jak i symulacje obejmujące wszystkie atomy pokazują, że penetracja narożników jest powiązana z małą barierą energetyczną porównywalną z energią cieplną i jest zasadniczo procesem spontanicznym.

Symulacje dynamiki molekularnej przejścia narożników monowarstwy grafenu przez dwuwarstwę lipidową. (A) Symulacje bezpośrednio pokazujące, że penetracja narożników następuje samoistnie. (B) Energia interakcji dwuwarstwy grafenu w funkcji odległości penetracji, wykazująca obecność bariery energetycznej około 5 kBT związanej z przebijaniem narożników. Średnią wartość energii interakcji wyznaczono z 11 niezależnych przebiegów symulacji, słupki błędów pokazują SD. Stosunkowo duże wahania energii oddziaływania przy dużych odległościach penetracji wynikają głównie z przypadkowych ruchów translacyjnych i rotacyjnych grafenu względem dwuwarstwowej membrany oraz przypadkowych zmian konfiguracyjnych poszczególnych lipidów sąsiadujących z grafenem. (C) Model analityczny przebicia narożnika.

Zarówno symulacje CGMD, jak i symulacje wszystkich atomów pokazują, że struktura dwuwarstwy lipidowej pozostaje zasadniczo nienaruszona po wstawieniu grafenu, z tym wyjątkiem, że hydrofobowe ogony lipidów są nieco osłabione ze względu na silną przyczepność do bocznych powierzchni grafenu. W opisie kontinuum zmianę energii związaną z przebijaniem można wyrazić czterema zmiennymi: hH i hT (grubość grup głowy i ogona w monowarstwie lipidowej, jak pokazano na ryc. 2C) oraz γH i γT (gęstości energii interakcji między ściana boczna grafenu oraz grupy głowy i ogona lipidów w stosunku do grupy rozpuszczalnika i grafenu). W przypadku narożnika grafenowego o kącie wewnętrznym 2α szybkość zmiany energii po przebiciu można opisać jako odcinkową funkcję głębokości penetracji h w następujący sposób.

Nasza symulacja obejmująca wszystkie atomy pokazana na ryc. 2A sugeruje, że istnieje dodatnia siła napędowa końcowego reżimu przebijania. W tych warunkach można zauważyć, że energia wzrasta w pierwszym reżimie, podczas gdy maleje w obu reżimach i . Szczyt energii występuje, gdy wierzchołek grafenu znajduje się w hydrofobowym rdzeniu, w punkcie określonym przez . Powoduje to, że bariera energetyczna do przebicia na krytycznej głębokości penetracji wynosi (…) Biorąc (…) i (…) pokazuje, że bariera energetyczna na przebicie narożników znajduje się na krytycznej głębokości penetracji wynoszącej . Liczby te doskonale zgadzają się z wynikami bezpośredniej symulacji SMD pokazanej na rysunku 2B.

Kuszące może być narysowanie analogii pomiędzy opisanym tutaj przebijaniem narożników grafenu w opisanej dwuwarstwie lipidowej a mechanicznym przebijaniem poprzez koncentrację naprężeń w ostrych narożnikach. Podkreślamy jednak, że ten pierwszy jest procesem zasadniczo spontanicznym, podczas gdy drugi napędzany jest przyłożoną siłą.

Eksperymenty bioobrazowe

Ryciny 3 i 4 przedstawiają fluorescencję konfokalną i mikrografy elektronowe ex situ, które potwierdzają przewidywania MD dotyczące początkowej penetracji krawędzi/narożników i penetracji komórek do mikroarkuszy grafenowych. Komórki nabłonka płuc i keratynocyty są reprezentatywne dla nabłonka wyściółki odpowiednio dróg oddechowych i skóry i tworzą in vitro płaskie, jednokomórkowe monowarstwy (ryc. 3). Spolaryzowane komórki nabłonkowe mają dobrze zorganizowaną mikrotubulową sieć cytoszkieletu, podczas gdy makrofagi mają podkorowe rozmieszczenie włókien aktynowych, które można uwidocznić za pomocą pośredniej mikroskopii konfokalnej immunofluorescencyjnej (ryc. 3 AC, wypustki). Mikroarkusze grafenowe w kształcie arkuszy są internalizowane przez ludzkie komórki nabłonka płuc (ryc. 3 A i B) oraz makrofagi (ryc. 3C) i można je uwidocznić w cytoplazmie za pomocą obrazowania konfokalnego. Interesujące jest to, że podstawowe płaszczyzny grafenu mają preferowaną orientację równoległą do podstawno-bocznej powierzchni komórki połączonej z podłożem.

Mikroarkusze grafenowe w kształcie płytek fizycznie zakłócają organizację cytoszkieletu zarówno komórek nabłonka płuc (ryc. 3 A i B), jak i makrofagów (ryc. 3C). W cienkich skrawkach za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) niektóre mikroarkusze grafenu można uwidocznić w wakuolach cytoplazmatycznych w makrofagach (ryc. 3D) i komórkach nabłonka płuc (ryc. 3E). Ogólna struktura i integralność organelli subkomórkowych są zachowane, jak pokazano za pomocą TEM (ryc. 3 D i E), potwierdzając nasze testy in vitro wykazujące zachowaną żywotność komórek (tekst SI i ryc. S8).

Wychwyt komórkowy i internalizacja wielowarstwowych mikroarkuszów grafenowych. (AC) Konfokalne obrazy ludzkich komórek nabłonka płuc (A i B) i mysich makrofagów (C) eksponowanych na mikroarkusze grafenowe (wymiar boczny od 0, 5 do 25 μm) odpowiednio po 24 godzinach i 5 godzinach. Jądra komórkowe w A i B wizualizuje się za pomocą 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) (niebieska fluorescencja). Mikrotubule komórek nabłonka płuc (A i B) są wizualizowane za pomocą przeciwciał antytubuliny beta sprzężonych z FITC (zielona fluorescencja), podczas gdy cytoszkielet aktynowy makrofagów w C jest wizualizowany za pomocą rodaminy i falloidyny (czerwona fluorescencja).

W nienaświetlonych komórkach nabłonka płuc (A i B, wstawka) mikrotubule cytoplazmatyczne (MT) tworzą liniową sieć obejmującą cytoplazmę. Zinternalizowane płatki grafenu (żółte strzałki, A i B) fizycznie wypierają liniową sieć mikrotubul. W nienaświetlonych makrofagach (C, wstawka) aktyna nitkowata (F) jest zorganizowana w agregaty pod błoną plazmatyczną. Zinternalizowane płatki grafenu o dużych wymiarach bocznych (żółty grot strzałki, C) indukują gęste agregaty włókien aktynowych, podczas gdy submikronowe arkusze grafenu (żółty grot strzałki, C) nie zakłócają cytoszkieletu aktynowego. Transmisyjne mikrografy elektronowe makrofagów (D) i komórek nabłonka płuc (E) eksponowane na błony FLG o grubości 10 ppm (∼800 nm w wymiarze bocznym) przez 5 i 24 godziny pokazują lokalizację cytoplazmatyczną w wakuolach związanych z błoną (niebieskie wstawki). Mikrowarstwy grafenu w wakuolach pojawiają się w postaci liniowych przekrojów o dużej gęstości elektronowej (D, wstawka) lub nieregularnych płatków (E, wstawka).

Interakcje między błonami komórkowymi a mikrowarstwami grafenu pokazujące penetrację krawędzi lub narożników dla każdego z trzech typów komórek. (A) Penetracja narożników arkusza grafenu o wymiarze poprzecznym wielkości mikrona na powierzchni ludzkiej komórki nabłonkowej płuc przy małym i dużym powiększeniu. (B) Penetracja krawędzi wielu mikrolistków (G) do makrofaga (M). (C) Penetracja krawędzi arkusza o grubości 5 μm wchodzącego w interakcję z pierwotnymi ludzkimi keratynocytami, gdzie wydaje się, że wejście krawędzi nastąpiło w miejscu guza lub występu (gruba żółta strzałka). (D) Tryb penetracji narożników na powierzchni pierwotnego ludzkiego keratynocytu.

Nachylona, pionowa orientacja arkusza grafenu tworzy na niektórych obrazach subtelne cienie wiązek elektrycznych bezpośrednio przylegające do arkusza. Bardzo nieregularną topografię krawędzi można zobaczyć na prawie wszystkich arkuszach grafenu. Wszystkie obrazy to obrazy emisji pola ze skaningowego mikroskopu elektronowego nieruchomych komórek z późniejszym utrwaleniem czterotlenkiem osmu. Czas ekspozycji wynosi 24 godziny, z wyjątkiem makrofagów, które eksponowano przez 5 godzin. Komórki w A i B nie zostały poddane suszeniu w punkcie krytycznym podczas przygotowania próbki do skaningowej mikroskopii elektronowej. Mikrowarstwy grafenu tutaj i na ryc. 3 mają numery warstw od 4 do 25 (pasek skali, 2 μm).

Protokoły obrazowania użyte na ryc. 3 są przydatne do pokazania internalizacji i orientacji wykresu, ale nie dostarczają informacji o trybie wprowadzania. Dlatego wykonaliśmy krótsze ekspozycje, aby uchwycić proces rejestracji, stosując SEM emisji polowej ex situ komórek docelowych, których zewnętrzna błona została wzmocniona przez późniejsze utrwalenie czterotlenkiem osmu. Aby uniknąć artefaktów związanych z suszeniem, zdjęcia te wykonano zarówno z suszeniem, jak i bez niego, w punkcie krytycznym. Rysunek 4 przedstawia obrazy o wysokiej rozdzielczości powierzchni komórek wystawionych na działanie grafenu odpowiednio po 5 i 24 godzinach. We wszystkich przypadkach i dla wszystkich trzech typów komórek docelowych penetrację błony można zobaczyć na krawędziach lub w rogach. Ryciny 4 C i D pokazują szczególnie wyraźne przypadki penetracji membrany, które wydają się rozpoczynać od wybrzuszenia lub występu na krawędzi grafenu (ryc. 4C) lub w narożniku grafenu (ryc. 4D).

Należy zwrócić uwagę, że krawędzie tych liści są bardzo nieregularne (ryc. 4 A, C i D) i zapewniają liczne miejsca początkowej penetracji, jak opisano w modelowaniu. Internalizacja tych mikroarkuszy grafenowych w kształcie płytek o wymiarze bocznym w zakresie od 0, 5 nm do 5 μm (tabela S1) nie miała wpływu na żywotność komórek w dawkach i punktach czasowych stosowanych w tych badaniach in vitro. Ogólnie jednak wdychanie nanocząstek może wiązać się z niekorzystnymi skutkami zdrowotnymi (41), a Schinwald i in. donieśli, że nanopłytki grafenu indukowały powstawanie ziarniniaków i zapalenie płuc u myszy po odsysaniu gardła.

Wychwyt wewnątrzkomórkowy i lokalizacja cytoplazmatyczna nanomateriałów grafenu w kształcie płytek krwi mogą wpływać na organizację cytoszkieletu (ryc. 3 AC) i normalne funkcje fizjologiczne, takie jak wydzielanie spolaryzowane, tworzenie bariery i migracja komórek podczas różnicowania i naprawy uszkodzenia nabłonka. Wykazano, że internalizacja nanocząstek przez makrofagi zakłóca fagocytozę i usuwanie cząstek i drobnoustrojów z płuc. Schinwalda i in. wykazali, że nanopłytki grafenu nie są łatwo usuwane z płuc i indukują uwalnianie mediatorów prozapalnych z makrofagów. Inne badania wskazują, że nanomateriały grafenowe są biokompatybilne. Zanim będzie można w pełni ocenić ryzyko zdrowotne stwarzane przez materiały grafenowe, potrzeba znacznie więcej pracy.

Podsumowując, do zbadania podstawowych mechanizmów interakcji grafenu z dwuwarstwami lipidowymi wykorzystano gruboziarnistą dynamikę molekularną, MD kierowane atomami, modelowanie analityczne oraz bioobrazowanie żywych komórek i ex situ. Symulacje pokazują bezpośrednią penetrację do dwuwarstwy, zaczynając od lokalnej penetracji w ostrych narożnikach lub w występach wzdłuż krawędzi grafenu, a następnie propagując wzdłuż krawędzi, aż do osiągnięcia pełnej penetracji. W małej płytce grafenowej ruchy Browna i entropiczne siły napędowe w obszarze blisko membrany powodują, że płytka jest początkowo ustawiona prostopadle do płaszczyzny dwuwarstwy, co następnie prowadzi do spontanicznego przebicia narożników.

Za pomocą symulacji dynamiki molekularnej wszystkich atomów śledzono rozwój energii swobodnej podczas penetracji narożników i pokazano jedynie niewielką barierę energetyczną, porównywalną z kBT. Co ciekawe, w przypadku braku ostrych narożników lub wystających krawędzi błona komórkowa ma wysoką wewnętrzną barierę energetyczną uniemożliwiającą penetrację długich segmentów krawędziowych grafenu, mimo że są one atomowo cienkie. Jednak takie jednolite, atomowo gładkie, ułożone poziomo, długie krawędzie grafenu są rzadkie, więc w praktyce penetracja komórek następuje spontanicznie, ponieważ chropowatość krawędzi występuje w skali atomowej lub nano, zasadniczo eliminując barierę energetyczną.

Eksperymentalne badania obrazowe potwierdzają przenikanie grafenu do błon komórkowych w dominującym trybie „od krawędzi” lub „od narożnika” dla każdego z trzech badanych typów komórek: komórek nabłonka płuc, keratynocytów i makrofagów. Eksperymenty pokazują również penetrację i pomyślny absorpcję płatków GFN o wielkości 5-10 μm w wymiarze poprzecznym, co potwierdza przewidywanie modelu, że bariery dla aktywacji penetracji w wyniku inicjacji w lokalnych ostrych elementach nie są z natury zależne od długości.

Eksperymenty wykazują również penetrację i pomyślny absorpcję płatków GFN o wielkości 5–10 μm w wymiarze poprzecznym, co potwierdza przewidywanie modelu, że bariery aktywacyjne utrudniające penetrację w wyniku inicjacji w lokalnych ostrych elementach nie są wewnętrznie zależne od długości. Po pokonaniu początkowej bariery energetycznej uniemożliwiającej spontaniczną penetrację błony stawiamy hipotezę, że interakcja między hydrofobowymi podstawowymi powierzchniami mikroarkuszów grafenu a wewnętrznym hydrofobowym obszarem błony komórkowej sprzyja wychwytowi komórkowemu. Powierzchnie hydrofobowe są uważane za wzorce molekularne związane z uszkodzeniami (DAMP), które nieswoiście aktywują wrodzoną odpowiedź immunologiczną.

Hydrofobowe powierzchnie komórkowe i nanocząstki funkcjonalizowane powierzchniowo są łatwiej internalizowane i wyzwalają silniejszą wrodzoną odpowiedź immunologiczną niż słabo naładowane powierzchnie hydrofilowe. W oparciu o ten mechanizm stawiamy hipotezę, że mikroarkusze grafenu penetrujące hydrofobowe domeny lipidowe mogą być rozpoznawane przez komórki docelowe jako DAMP, które stanowią pierwszą linię obrony przed cząsteczkami i drobnoustrojami zamieszkującymi skórę lub wyściółkę nabłonka po inhalacji płuc. Zdolność mikroarkuszy grafenowych do penetracji komórek o dużym zasięgu poprzecznym, udokumentowana tutaj zarówno eksperymentalnie, jak i poprzez symulacje, może prowadzić do zakłócenia cytoszkieletu, upośledzenia ruchliwości komórek, upośledzenia funkcji bariery nabłonkowej lub innych efektów geometrycznych i sterycznych wymaga dalszych badań.

Materiały i metody – Gruboziarniste symulacje MD

Symulacje gruboziarniste zastosowane w tej pracy opierają się na DPD, metodzie Lagrangianu wywodzącej się z gruboziarnistej natury dynamiki molekularnej i szeroko stosowanej jako mezoskopowa metoda symulacji systemów biomembran. Błonę dwuwarstwową lipidową reprezentuje model gruboziarnisty H3(T5)2. Hydrofilowe głowy lipidów i hydrofobowe ogony lipidów pokazano odpowiednio jako czerwone i żółte kulki. Komórka elementarna grafenu CG składa się z trzech kulek o odległości najbliższego sąsiada wynoszącej 0,4 nm i kącie wewnętrznym 60°. Oddziaływania pomiędzy kulkami dobiera się tak, aby właściwości sprężyste CG-grafenu zgadzały się z wynikami eksperymentalnymi. Parametry interakcji między cząsteczkami grafenu i lipidów są kalibrowane przy użyciu parametrów z symulacji MD wszystkich atomów, a także różnią się w pewnym zakresie w celu sprawdzenia wiarygodności kluczowych obserwacji. Symulacje przeprowadza się w zespołach liczbowo-objętościowo-temperaturowych (NVT) z krokiem czasowym i przeprowadza się je za pomocą pakietu oprogramowania LAMMPS.

Symulacje MD wszystkich atomów

Symulacje MD wszystkich atomów przeprowadzono w NAMD i wizualizowano w VMD. Dwuwarstwową membranę grafenową i POPC-lipidową utworzono odpowiednio przy użyciu VMD Graphene Builder i Membrane Builder. Układ dwuwarstwy grafenowo-lipidowej został następnie całkowicie uwodorniony (dodając cząsteczki wody) przy użyciu VMD. Do symulacji wykorzystano pole siłowe CHARMM36 z dodatkowymi parametrami dla grafenu i modelu wody TIP3. Symulacje składały się z dwóch etapów równowagi i jednego etapu produkcji. Ponieważ błony lipidowe utworzone za pomocą wtyczki membranowej VMD były dalekie od równowagi, przeprowadzono przebieg równowagi trwający 0,5 ns, utrwalając wszystko z wyjątkiem ogonów lipidowych.

Ten pierwszy etap umożliwił stopienie ogonów lipidowych w konfigurację przypominającą ciecz. W drugim etapie układy równoważono w układzie liczba-ciśnienie-temperatura (NPT) przez około 2 ns w temperaturze 310 K i pod ciśnieniem 1 atm. Trzecim krokiem były serie produkcyjne. Na wszystkich trzech etapach symulacji pozapłaszczyznowe stopnie swobody atomów węgla w płatkach grafenu były ograniczone więzami harmonicznymi.

Eksperymenty bioobrazowe

Doświadczenia przeprowadzono na trzech typach komórek: mysich makrofagach, komórkach nabłonka płuc i pierwotnych ludzkich keratynocytach. Komórki poddano działaniu komercyjnych próbek mikrowarstw grafenu o różnych wymiarach poprzecznych (0,5–10 μm) i liczbie warstw. Próbki FLG zdyspergowano w 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinie (DPPC) (lipidy Avanti Polar)/albuminie przed dodaniem do pożywki do hodowli komórkowej (rys. S10). Sto mikrolitrów płatków grafenu w roztworze podstawowym 5 mg/ml etanolu dodano do 62 µl roztworu DPPC/etanol o stężeniu 40 mg/ml i wytrząsano przez 5 s, a następnie dodano 838 µl 2% PBS (obj. /obj.) albumina do podstawowego roztworu grafenu o stężeniu 500 μg/ml (ppm) z 2,5 mg DPPC i 2% w celu otrzymania albuminy/PBS.

Ilość zaadsorbowanego białka wynikająca z zastosowania tego protokołu mierzono w oddzielnych doświadczeniach kontrolnych i wynosiła 3–46% pola powierzchni GFN, w zależności od warunków i próbki (tekst SI). W przypadku keratynocytów roztwór podstawowy grafenu rozcieńczono do 10 μg/ml grafenu w pożywce podstawowej dla komórek skóry właściwej zawierającej suplementy wzrostu keratynocytów, natomiast RPMI 1640 służyło jako podłoże rozcieńczające dla makrofagów i komórek nabłonka płuc.

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna

Komórki nabłonka płuc eksponowano na płatki grafenu przez 24 godziny. Komórki przemywano i barwiono przeciwciałem antytubuliny skoniugowanym z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (Cell Signaling; 3623S) i 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI). Makrofagi wystawiono na działanie grafenu przez 5 godzin, jak opisano powyżej. Komórki przemywano i barwiono falloidyną sprzężoną z rodaminą i DAPI. Obrazy wizualizowano przy użyciu konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego ze stołem obrotowym Olympus (model IX81) i zmotoryzowanego mikroskopu odwróconego w celu oceny wychwytu i organizacji cytoszkieletu.

Mikroskopia elektronowa

Do przygotowania próbki TEM zastosowano dwie różne metody, aby sprawdzić, czy płatki grafenu zostały wchłonięte przez komórki. Komórki zawieszano w utrwalaczu Karnovsky’ego [5% (obj./obj.) aldehydu glutarowego, 4% (obj./obj.) formaldehydu w 0,1 M buforze kakodylanu sodu, pH 7,4] (Electron Microscopy Sciences; 11650, a następnie przepłukano trzykrotnie). z 0,1 M buforem kakodylanu sodu i 2% (obj./obj.) roztworem wodnym Czterotlenek osmu (Electron Microscopy Sciences; RT 19152) utrwalono później. Próbki odwadniano w lodowatych roztworach etanolu, a następnie w lodowatym bezwodnym acetonie. Próbki infiltrowano żywicą Durcupan ACM (Electron Microscopy Sciences) ze zmniejszającymi się proporcjami acetonu, a na koniec samym Durcupanem.

Mikroskopia elektronowa

Komórki zatopiono w Durcupan i polimeryzowano w temperaturze 60°C przez 48 godzin. Bloki komórkowe pocięto na cienkie skrawki na ultramikrotomie Reichert Ultracut za pomocą noża diamentowego (komórki niepoddane obróbce) lub noża szklanego przy 80 nm. Skrawki umieszczono na siatkach miedzianych i oglądano w transmisyjnym mikroskopie elektronowym Philips 410 z kamerą CCD Advantage HR. Obrazy uzyskano przy użyciu oprogramowania do obrazowania Advanced Microscopy Techniques.

Wewnątrzkomórkową lokalizację nanoarkuszów grafenu potwierdzono także poprzez cięcie komórek hodowanych w monowarstwie na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Do skaningowej mikroskopii elektronowej komórki utrwalano w 2% (obj./obj.) wodnym roztworze czterotlenku osmu przez 30 minut, a następnie w 25% (obj./obj.), 50% (obj./obj.), 70% (obj./obj.) , 2 × 95% (obj./obj.) i 3 × 100% (obj./obj.) etanol odwodniony. Po wysuszeniu w punkcie krytycznym zgodnie z instrukcjami producenta (Ladd Research), szkiełka nakrywkowe posypano złotem i zbadano za pomocą emisji polowej SEM (LEO 1530-VP).

Powiązane

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,klik nij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

MFORUM VIDEO LIVE INFO NIUS Informacje prasowe , video stream , podcast ,reportaż, audiobook , film fabularny, film dokumentalny , relacje ,transmisje , retransmisje publikacje , republikacje materiały tłumaczone na język polski , komunikator chat audio i video , największe w Polsce archiwum materiałów video i art. prasowych trwale usuniętych z internetu ,codziennie najnowsze informacje bez cenzury nie dostępne w Polskim internecie .Audycje stream live w każdy dzień z wyjątkiem piątku i soboty o godzinie 20 .00 dostępna funkcja translator z możliwością tłumaczenia zawartości całej witryny na 93 języki w tym treści chat !!¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶1_________________1¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶1___111_1111111_1____¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶1_1881188111111111____¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶881188__¶___8111_______¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶8881____1__________________¶¶¶¶¶¶¶¶¶888¶¶¶¶ ¶11188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶881__________818¶¶¶¶¶¶¶¶18¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶81___1¶_1¶¶¶¶¶¶¶¶¶11¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶818¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶18¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8888¶¶¶¶¶¶¶¶81¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶88888¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶81¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶881111111111_11118888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶81¶ ¶¶¶¶¶881881181111118¶¶¶88111111_____8¶¶¶¶¶¶1¶ ¶¶¶¶¶8¶¶¶81111118¶¶¶¶¶81111881111_____1¶¶¶¶1¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶811118¶81111__118111111111___8¶8_¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶1__1888¶¶¶¶¶¶¶8______11181___18¶ ¶¶¶¶¶¶81118¶¶8_____18188881_______11181__888¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8881____________________1118118¶__¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶881_81___________________111181_188_¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶81_1¶8__________________1111881_____¶ ¶¶¶¶¶8111_118______11_________1111888811____¶ ¶¶¶¶¶81111181__18¶8111___1_111111811111_____¶ ¶¶¶¶¶¶8111_8¶¶¶¶¶¶¶8______1111111111111___18¶ ¶¶¶¶¶¶¶81111¶¶¶¶1____________111111111¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶8111¶¶1_______________1111111888¶¶¶8¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶81118¶88¶¶¶8881_____1111111188_18¶_¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶818¶¶8111__1___111111111118¶811188¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8188888¶¶881111181111118¶¶8111188¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶¶¶811111111111188¶¶81111181¶ ¶¶¶¶¶¶8888¶¶¶¶¶8____________188¶¶¶¶8111111_1¶ ¶¶¶¶81111¶¶¶¶¶811_1111___118¶¶¶¶¶¶81111111_¶¶ ¶¶¶811_1¶¶¶¶¶¶¶88888¶¶¶¶8¶¶¶¶¶¶¶¶81111111_8¶¶ ¶81___1¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶88811118__¶¶¶ ¶___8¶¶¶88¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶888881888_¶8_¶ ¶81_¶¶8888¶¶¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶888888888__¶8__¶ ¶¶¶¶1__1¶¶¶888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶888888881___1¶¶¶ ¶¶88¶¶8_81_1¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8¶88881_11¶¶¶88¶ ¶¶1_18¶¶8__¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶88__8¶¶¶¶1_1¶ ¶81_1118¶¶¶__1¶¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ 888888888888888888888888888888888888888888888 8___________________________________________8 8__¶¶¶¶¶_¶¶___¶¶_¶¶¶¶_¶¶__¶¶_¶¶¶¶¶_¶¶___¶¶__8 8__¶¶____¶¶¶_¶¶¶__¶¶__¶¶¶_¶¶_¶¶____¶¶¶_¶¶¶__8 8__¶¶¶¶__¶¶_¶_¶¶__¶¶__¶¶_¶¶¶_¶¶¶¶__¶¶_¶_¶¶__8 8__¶¶____¶¶___¶¶__¶¶__¶¶__¶¶_¶¶____¶¶___¶¶__8 8__¶¶¶¶¶_¶¶___¶¶_¶¶¶¶_¶¶__¶¶_¶¶¶¶¶_¶¶___¶¶__8 8___________________________________________8 888888888888888888888888888888888888888888888 211_1_1____2¶¶¶¶66¶¶¶¶¶¶¶88¶88__¶888¶¶2________126 __________¶¶¶¶¶12¶¶¶¶¶8¶¶¶866¶612¶8¶¶¶6_1_________ 211_1___6¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶866¶¶66¶822¶¶8886681_______ 1111____2¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8688¶¶8_8¶2168¶61126_______ 21___268¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶¶¶68¶6_188__666______ 11__12¶¶¶¶¶¶228¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶68¶2_26¶2_2861____ 1__16¶¶¶¶¶6___¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶61¶¶_¶¶6¶____122__ 1__8¶¶¶¶¶6____6¶¶¶¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶218¶18¶61¶1______1 2186¶¶¶¶2_1____28682¶8¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶_68266¶1_2¶1_____ 6862¶¶¶¶__1_____6___26_16¶8¶¶¶8__¶211612¶8_¶¶81886 ¶88¶¶¶¶81_1____12________________¶¶1_11_6¶_2¶¶2___ 6¶¶¶¶¶¶6__2____1________________2_88_2_1_¶1¶8661__ 1_¶¶¶¶¶2__8______________________1¶22____¶688¶¶12_ _2¶¶¶¶¶8__21_1_11_____________1__¶__11_1_¶81¶¶¶1__ _2¶¶¶¶¶¶1_2621_1________________18___26__2¶2_¶¶___ 28_¶¶¶¶¶1__262_____1_______1_____2___1611_8¶126___ 8__¶¶¶¶¶2_282_______________1____2___62_2__2¶¶6___ __2¶8¶8¶6_6¶¶¶8182______________622__16__12__82___ __¶2_2¶¶¶_6¶¶¶¶¶¶¶¶12__61_2¶¶¶¶¶¶¶¶66_6___¶¶21112_ 1_81__8¶¶__6¶¶268¶¶¶¶61¶¶¶¶¶¶¶2_18¶¶1__1_2¶¶¶2_1_1 8_22__1¶¶1__6¶¶¶¶¶¶¶¶_____¶¶¶¶¶¶¶_1¶____1¶¶¶¶8____ 1_22__1¶¶8____6¶¶¶2__________81___6______¶¶¶¶¶2___ _______¶¶¶2_______________________2______626¶¶6___ _______8¶¶6_______16__________________1__¶¶¶¶8¶81_ _____686¶¶¶¶2___12______________________¶¶¶¶8¶¶¶86 ___2¶¶¶¶8¶¶¶6_____26_______________16___¶¶¶¶¶¶¶¶¶6 86¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶221__2¶881__________22_____¶¶¶¶¶128¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶882_16_____¶¶¶21____1_1¶¶¶¶¶228¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶8¶¶¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶62¶¶¶8___2___¶¶¶¶¶¶86¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8162__6¶¶¶¶¶¶66_______6____¶¶¶¶¶¶66¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶66___88¶88________¶¶____¶¶¶¶¶¶862¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶6¶1____________¶¶¶1___¶¶¶¶¶¶¶¶626¶ ¶¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶¶2¶8¶¶¶2_________2¶81___2¶¶¶¶¶¶¶¶86618 ¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶¶¶2¶¶¶¶8¶¶¶8¶622¶¶¶_____6¶¶¶¶¶8¶¶¶8288¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8¶¶8888¶628¶¶¶¶¶2¶¶6____1¶¶¶¶¶8¶¶¶8¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶6¶¶8¶¶2666866¶¶¶¶¶¶_¶¶¶____6¶¶¶¶¶8¶¶68¶¶8¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶68¶6¶¶668628¶¶¶¶¶¶82¶¶¶¶__1¶¶¶¶¶62¶¶68¶¶88 ¶¶¶¶¶¶¶¶6¶¶¶¶¶¶6666¶¶¶8¶2118¶¶¶¶6_8¶¶¶¶¶128¶6¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶88¶¶862¶¶¶8¶¶2826¶¶¶¶¶¶¶¶66¶¶16¶¶¶¶¶¶¶8 ¶¶¶¶¶¶¶¶8¶¶¶2¶¶¶8¶¶¶28¶¶¶¶_2¶¶¶8¶¶¶22¶¶618¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶82¶¶28¶¶¶¶8_28¶¶¶2__¶881_¶618¶¶12¶¶¶¶¶¶¶¶¶ _________________11888888111 ____________1¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶81 __________8¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8 ________8¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ _______¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶1 ______¶¶¶¶¶¶811111188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ _____¶¶¶8_____________18¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ____¶¶¶1_______________118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ___¶¶¶1_________________18¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8 __8¶¶¶11_______________1188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ _8¶¶¶¶1______________111111888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ 8¶¶¶¶11____________________1118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶1 ¶¶¶¶¶11_____________________118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶1 8¶¶¶¶1___11______1888111111888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8 ¶¶¶¶¶¶8888¶¶8___8¶¶¶888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶8¶¶¶¶1_1¶¶¶1_¶¶¶¶¶¶¶118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶181_8¶81__1¶¶1___1181____1¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶____11____1881__________18¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶__________1111________118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶8_________111________1188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶_____1____111_____11188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶81_1118_1¶¶¶¶____1118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶881___8¶¶¶¶8__1111888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶18888__18888¶¶8111888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶8118881188¶¶¶81__1188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶81___18¶¶881111118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶81____11111118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶1_____1118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶88¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶_1188¶¶¶¶¶¶¶8888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶11111888888811188¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶811111118111111888¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶81_11111111111__1_1118¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶8811___1__111__________18¶¶¶¶¶8¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶811___1_______________1111¶¶¶¶¶88¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶1______________________1111¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶81_______________________1118¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶1________________________118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶81_____________________111118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶8881_________________________118¶¶¶¶¶¶¶¶88 ¶¶111__________________________118¶¶¶¶¶¶88881 ¶81____________________________1188888¶811111 ¶¶1______________________________11888118¶¶¶¶ ¶¶¶81___________________________118¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶81111__________________8¶8¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶88111_________18¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶ ¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶¶

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Wyraź swoją opinię ! TO WAŻNE !!Anuluj pisanie odpowiedzi

Ta strona używa Akismet do redukcji spamu. Dowiedz się, w jaki sposób przetwarzane są dane Twoich komentarzy.

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,klik nij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

TEN MATERIAŁ JEST ZABLOKOWANY ,kliknij kup teraz aby go widzieć I ODBLOKOWAĆ WSZYSTKIE ZABLOKOWANE TREŚCI NA STRONIE W TYM STREAM VIDEO BLOKADA BĘDZIE ZDJĘTA NA OKRES 30 DNI

Formularz zamówienia

Nazwa	Przelew
Dostęp do treści	102.00 zł

	wadam12 na FDA wstrzymuje publikację bada…
	Mforum na Szef upadłej giełdy kryptowalu…
	Mforum na Pliki Epsteina: Tom Hanks ‘Umi…
	Mforum na Pliki Epsteina: Tom Hanks ‘Umi…
	lukiant na Pliki Epsteina: Tom Hanks ‘Umi…

ABY ZOBACZYĆ WYBRANY MATERIAŁ PROSZE PRZESUNĄĆ STRONĘ W DÓŁ

NAWIGACJA STRONY DLA TEL / MOBIL >>>>

1. Obrazowanie i obserwacje:

Eksperymenty z fluorescencją konfokalną i mikroskopią elektronową wykazały, że grafen wnika do komórek od krawędzi, co prowadzi do całkowitej internalizacji.

Takie zachowanie zaobserwowano dla różnych próbek FLG o wymiarach bocznych w zakresie od 0,5 do 10 µm.

2. Symulacje i bariery energetyczne:

Symulacje dynamiki molekularnej (zarówno gruboziarnistej, jak i na poziomie atomowym) wykazały wysokie bariery energetyczne dla bezpośredniej penetracji arkuszy grafenu w membrany, co sugeruje, że zwykła penetracja membrany jest energetycznie niekorzystna.

3. Mechanizm penetracji:

4. Spójność wychwytu komórek:

Proponowany mechanizm wyjaśnia, w jaki sposób komórki mogą pomieścić duże arkusze grafenu i jest zgodny z wynikami bioobrazowania obserwowanymi w ludzkich keratynocytach, komórkach nabłonka płuc i mysich makrofagach.

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Implikacje

Wyniki i dyskusja – Gruboziarnista dynamika molekularna (CGMD)

Symulacje dla wszystkich atomów

Eksperymenty bioobrazowe

Materiały i metody – Gruboziarniste symulacje MD

Symulacje MD wszystkich atomów

Eksperymenty bioobrazowe

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna

Mikroskopia elektronowa

Mikroskopia elektronowa

Udostępnij:

Dodaj do ulubionych:

Powiązane

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia

Formularz zamówienia