PRZESUŃ STRONĘ W DÓŁ ABY ZOBACZYĆ

 WYBRANĄ TREŚĆ

Stream odblokowany w środę o 21.00

Stream zablokowany - "premium" w każdą niedzielę poniedziałek wtorek i czwartek o 21.00

NAJNOWSZE I NAJPOPULARNIEJSZE FILMY
Europe czeka ruina
Posted on 24 czerwca 2022 by mkhedrioni
1871 views
Co sie stalo z Polakami
Posted on 24 czerwca 2022 by mkhedrioni
148 views
Szokujące odkrycie w kraterze Von Karman
Posted on 23 czerwca 2022 by Mforum
404 views
NADCHODZI WIELKI GŁÓD O KTÓRYM MÓWIĄ WSZYSCY - JAK POLACY WALCZYLI Z GŁODEM W CZSIE II W.Ś ?
Posted on 23 czerwca 2022 by Mforum
1309 views
To dopiero początek...
Posted on 23 czerwca 2022 by Enigma2021
397 views
W Polsce zaczyna brakować ciepłej wody
Posted on 23 czerwca 2022 by Enigma2021
124 views
Utrata mieszan i nieruchomosci przez Polakow .
Posted on 23 czerwca 2022 by mkhedrioni
228 views
Ciezie czasy dla Kijowa
Posted on 23 czerwca 2022 by mkhedrioni
146 views
KROK PO KROKU DZIEŃ PO DNIU POLACY ODDAJĄ POLSKĘ
Posted on 23 czerwca 2022 by Mforum
209 views
Bitcoin i zielona energia
Posted on 23 czerwca 2022 by mkhedrioni
103 views
Jackowski koncowa czerwca
Posted on 23 czerwca 2022 by mkhedrioni
103 views
Leszek Zebrowski ruch narodowy  nie zniszczyl sie sam
Posted on 23 czerwca 2022 by mkhedrioni
129 views
To dopiero poczatek
Posted on 23 czerwca 2022 by mkhedrioni
100 views
Morawiecki Covid wroci jesienia
Posted on 23 czerwca 2022 by mkhedrioni
103 views
Rosja wchodzi w NOWY PORZĄDEK ŚWIATOWY! Przemówienie W. Putina na Forum Ekonomicznym (po polsku
Posted on 23 czerwca 2022 by Enigma2021
125 views
22.06.2022 STREAM - TO OSTATNI MOMENT NA BLOKADĘ NOWYCH UKRAIŃSKICH ELIT - POLACY BEDĄ MARGINESEM
Posted on 22 czerwca 2022 by Mforum
413 views
Tajny Projekt MK-ULTRA i Podprojekt 94
Posted on 21 czerwca 2022 by Mforum
2074 views
Patrioci czy idioci
Posted on 21 czerwca 2022 by mkhedrioni
240 views
Czy Putin zaatakuje Polske
Posted on 21 czerwca 2022 by mkhedrioni
385 views
Bitcoin _Zielona energia
Posted on 21 czerwca 2022 by mkhedrioni
154 views
Patryk lancaster Donieck
Posted on 21 czerwca 2022 by mkhedrioni
147 views
Tajny Projekt MK-ULTRA
Posted on 21 czerwca 2022 by mkhedrioni
127 views
Siemion Mogilewicz-Gangster ktory zaopatrywal Polske w gas
Posted on 21 czerwca 2022 by mkhedrioni
127 views
WPolsce zaczyna brakowac cieplej wody
Posted on 21 czerwca 2022 by mkhedrioni
178 views
PIS zamierza zaakceptowac kult Stepana Bandery
Posted on 20 czerwca 2022 by mkhedrioni
1551 views
20.06.2022 STREAM - POSEŁ A. KOŁAKOWSKI - PIS I M.MACIAK CW24TV - WSPÓLNY POGLĄD NA JUMANIE BIEDNYCH STARCÓW  - REPORTAŻ !!
Posted on 20 czerwca 2022 by Mforum
316 views
Muzeum Faberge.Najwiesze prywatne muzeum w Rosji
Posted on 20 czerwca 2022 by mkhedrioni
490 views
Ukrainsi Front 20.06.22
Posted on 20 czerwca 2022 by mkhedrioni
146 views
Czego zyczysz Morawieckiemu
Posted on 20 czerwca 2022 by mkhedrioni
205 views
Doradca Dudy o Rzeczypospolitej wielu narodow
Posted on 20 czerwca 2022 by mkhedrioni
166 views
POLAK POZBAWIONY MAJATKU BO WSZEDŁ W KONFLIKT Z POSŁEM PIS
Posted on 20 czerwca 2022 by Mforum
718 views
Incydent w Ong's Hat - Otwarcie Bramy do Innego Świata
Posted on 19 czerwca 2022 by Mforum
1424 views
Ivans Bobrows LIVE
Posted on 19 czerwca 2022 by mkhedrioni
150 views
Co sie stalo moze stac sie wkrotce
Posted on 19 czerwca 2022 by mkhedrioni
200 views
Ostrzal Doniecka Patrick Lancaster
Posted on 19 czerwca 2022 by mkhedrioni
180 views
Ukrainsi front 19-06.22
Posted on 19 czerwca 2022 by mkhedrioni
369 views
Otwarcie bramy do innego swiata
Posted on 19 czerwca 2022 by mkhedrioni
148 views
Afera stulecia.Rosyjscy agEnci w Polsim Rzadzie.
Posted on 19 czerwca 2022 by mkhedrioni
156 views
Puszcza nas z torbami
Posted on 17 czerwca 2022 by mkhedrioni
2522 views
Wizja inne niz wszystkie
Posted on 17 czerwca 2022 by mkhedrioni
286 views
Jasnowidz Jacowski Polska suwerennosc.
Posted on 17 czerwca 2022 by mkhedrioni
293 views
Zamek Czocha Dariusz Kwiecien
Posted on 17 czerwca 2022 by mkhedrioni
212 views
Jozef Bialek cyfrowy swiat
Posted on 17 czerwca 2022 by mkhedrioni
178 views
Ukrainski front 17.06.22
Posted on 17 czerwca 2022 by mkhedrioni
144 views
Sladami podroznikow w czasie
Posted on 17 czerwca 2022 by mkhedrioni
153 views
Rosja jeszcze nie byla tak bogata
Posted on 17 czerwca 2022 by mkhedrioni
152 views
Maciej Rybus niech sie Panu wiedzie
Posted on 17 czerwca 2022 by mkhedrioni
169 views
MKTV- Sprawy biezace
Posted on 17 czerwca 2022 by mkhedrioni
184 views
Jozef Bialek o co chodzi z Ukraina
Posted on 17 czerwca 2022 by mkhedrioni
172 views
Polska pod rządami żydowskimi  Continue reading at Video Form | M-forum A.V Live.
Posted on 17 czerwca 2022 by Enigma2021
997 views
POLITYKA STRONY M-FORUM !!! - WSZYSTKIE ZAMIESZCZANE MATERIAŁY ORAZ PREZENTOWANE I PROPAGOWANE - Poglądy i opinie zawarte w artykułach mogą być niezgodne ze stanowiskiem redakcji. !!!! REDAKCJA M-FORUM AV LIVE MA NA CELU PUBLIKOWANIE WSZYSTKICH INFORMACJI KTÓRE SĄ CENZUROWANE BEZ WZGLĘDU NA ZABARWIENIA POLITYCZNE , RELIGIJNE I OBYCZAJOWE - ZA KOMENTARZE I WYPOWIEDZI CZYTELNIKÓW I WIDZÓW NIE BIERZE ODPOWIEDZIALNOŚCI , Z WYJĄTKIEM TREŚCI O CHARAKTERZE PRZESTĘPCZYM KTÓRE BĘDĄ USUWANE BEZ OSTRZEŻEŃ

M-forum A.V Live.

TO. PORTAL NA KTÓRYM CODZIENNIE ZNAJDZIESZ PONAD 100 INFORMACJI INFO NIUS W TYM MATERIAŁY CENZUROWANE LUB ZABRONIONE NA INNYCH PORTALACH POPRAWNYCH POLITYCZNIE. W sprawach dotyczacych reklamy banerowej lub video, oraz zasad dzierżawy strumienia stream bez limitu umieszczanego na dowolnej stronie internetowej , proszę przesunąć stronę w dół lewa strona sekcja ADMIN KONTAKT

Jad węży jest ostatnio reklamowany jako lek „anty-HIV” od stycznia 2022 roku. Te syntetyczne jady węży są sprzedawane jako „przeciwwirusowe” i zapobiegające zakażeniu wirusem HIV.

Postaw mi kawę na buycoffee.to
5/5 - (1 vote)

Jad węży jest ostatnio reklamowany jako lek „anty-HIV” od stycznia 2022 roku . Jest sześć PLA2 z patentów Snake Venoms „przeciwko HIV”. Te syntetyczne jady węży są sprzedawane pod przykrywką jako „przeciwwirusowe” i jako środek zapobiegający zakażeniu wirusem HIV.

WESPRZYJ DOWOLNĄ KWOTĄ NASZĄ

DZIAŁALNOŚĆ 

Ta forma wsparcia adresowana jest do autorów wpisów - artykułów , filmów i tłumaczeń i osób pomagających w sprawach technicznych ,

ciekawostka :-) mamy ponad 30 000 subskrybentów i ponad 100 000 osób zarejestrowanych  a trzeba żebrać o kilka groszy dla tych dzięki którym są treści na stronie .......... 

Od początku trwającej ponad 30 lat epidemii HIV głównym celem naukowców było opracowanie skutecznych metod zapobiegania i leczenia zakażenia HIV. Nowoczesne leki zmniejszyły śmiertelność z powodu AIDS o 80%. Jednak nadal mają skutki uboczne i są bardzo drogie, dyktując potrzebę poszukiwania nowych leków. Wcześniej wykazano, że fosfolipazy A2 (PLA2) z jadów pszczół i węży blokują replikację HIV, a efekt jest niezależny od aktywności katalitycznej PLA2. Jednak aktywność przeciwwirusowa ludzkich PLA2 przeciwko Lentiwirusom zależała od funkcji katalitycznej i pośredniczyła w niszczeniu błony wirusowej. Aby wyjaśnić rolę aktywności fosfolipolitycznej w działaniu przeciwwirusowym, przeanalizowaliśmy aktywność przeciw HIV kilku węży PLA2 i stwierdziliśmy, że mechanizmy ich aktywności przeciwwirusowej były podobne do mechanizmów PLA2 ssaków.

Nasze wyniki wskazują, że WĘŻE PLA2 są zdolne do hamowania tworzenia się syncytu między komórkami przewlekle zakażonymi HIV a zdrowymi komórkami CD4-dodatnimi i blokują wiązanie HIV z komórkami. Jednak tylko dimeryczne PLA2 miały wyraźną aktywność wirusobójczą i anty-HIV, która zależała od ich aktywności katalitycznej. Zdolność węży PLA2 do inaktywacji wirusa może stanowić dodatkową barierę dla zakażenia HIV. Tak więc wąż PLA2 może być uważany za kandydata na cząsteczki ołowiu w opracowywaniu leków przeciw HIV.

Słowa kluczowe: aktywność przeciwwirusowa, ludzki wirus niedoboru odporności, fosfolipaza A2, pseudowirus, retrowirus, jad węża, syncytium, postać rekombinowana

1. Wprowadzenie

Ludzkie wirusy niedoboru odporności (HIV) to dwa gatunki retrowirusów z rodzaju Lentivirus, które powodują powoli postępującą chorobę: zakażenie HIV, w którym praca układu odpornościowego jest tłumiona, i rozwija się zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS). Istnieją dwa typy HIV: HIV-1 i HIV-2, różniące się pochodzeniem [1]. Podczas AIDS postępująca niewydolność układu odpornościowego powoduje zagrażające życiu infekcje oportunistyczne i nowotwory, które nie są charakterystyczne dla osób o normalnym stanie odpornościowym. Zdrowi ludzie mogą zarazić się WIRUSEM HIV od zakażonych osób poprzez wymianę płynów ustrojowych (krew, mleko matki, nasienie i wydzieliny z pochwy); przenoszenie wirusa HIV przez błonę śluzową narządów płciowych jest ważną drogą zakażeń HIV u ludzi [2].

Na poziomie molekularnym zakażenie HIV występuje poprzez interakcję glikoproteiny wirusowej gp120 z komórkowym receptorem CD4 [3] i koreceptorami chemokiny, zwykle CCR5 we wczesnej fazie zakażenia i CXCR4 w późniejszych stadiach choroby [4,5]. Jednak HIV może infekować komórki zarówno jako wirus bezkomórkowy, jak i poprzez komórki zakażone wirusem, które wyrażają antygeny specyficzne dla wirusa na błonach i wytwarzają cząsteczki wirusa [6,7]. Wiązanie HIV z komórkami docelowymi i fuzja zakażonych HIV i niezakażonych limfocytów T wymaga wieloetapowych interakcji glikoprotein otoczki wirusowej gp120 / gp41 z komórkowym receptorem CD4 i koreceptorem HIV CCR5 i / lub CXCR4 [8]. Po związaniu się z receptorami komórkowymi kompleks gp120/gp41 ulega zmianom konformacyjnym, które sprzyjają fuzji błony wirusowej z docelową błoną komórkową [9,10]. Po fuzji wirus-komórka następuje odmalowanie wirionu [11] w celu uwolnienia kompleksu odwrotnej transkrypcji (RT), który oddziela się od błony plazmatycznej i przenosi się do jądra komórkowego [12]. Następnie wirusowe DNA wchodzi do jądra komórkowego, gdzie integraza wirusowa ułatwia integrację liniowych form prowirusowego DNA z chromosomami komórki gospodarza [13].

Skuteczna profilaktyka HIV powinna mieć na celu powstrzymanie rozprzestrzeniania się zarówno wirusów związanych z komórkami, jak i wolnych. Dlatego nowe związki zdolne do inaktywacji wirusa pozakomórkowego i blokowania fuzji komórek za pośrednictwem HIV mogą być obiecującymi lekami chroniącymi komórki przed zakażeniem HIV.

Produkty naturalne zawierają ogromną gamę związków o szerokiej gamie struktur chemicznych i aktywności biologicznej, co czyni je ważnym źródłem substancji do opracowywania nowych leków. Wśród takich naturalnych produktów jadami są złożone mieszaniny, w tym różne składniki natury enzymatycznej (metaloproteinazy, proteinazy serynowe, fosfolipazy A2, oksydazy L-aminokwasowe itp.) i nieenzymatycznej (neurotoksyny, cytotoksyny, dezinegryny itp.), Które mogą dostarczyć wskazówek do rozwoju terapeutycznie użytecznych cząsteczek [14].

Wydzielane fosfolipazy A2 (PLA2) znaleziono w tkankach ssaków i jadach zwierzęcych i katalizują hydrolizę glicerofosfolipidów z uwalnianiem wolnych kwasów tłuszczowych i lizofosfolipidów [15,16,17]. Zostały one podzielone na różne typy w oparciu o sekwencje aminokwasów oraz liczbę i położenie reszt cysteiny [18,19]. Wydzielnicze PLA2 (sPLA2) stanowią ponad jedną trzecią członków nadrodziny PLA2 i są podzielone na 10 grup i 18 podgrup. Jad węża PLA2 należy do grup IA (Elapidae i Hydrophidae venoms) i II (Crotalidae i Viperidae venoms) [20]. Kilka PLA2 z grupy IIA to niekowalencyjne dimery utworzone przez enzymatycznie aktywną podjednostkę i nieaktywną podjednostkę, HDP-I i HDP-II z jadu Vipera nikolskii są przykładami takich dimerów [21]. Wcześniejsze badania wykazały, że PLA2 mają różne działania biologiczne, w tym przeciwnowotworowe [22,23], przeciwbakteryjne [24] i przeciwwirusowe [25,26,27].

Wcześniej wykazano, że PLA2 wyizolowane z jadów pszczół i węży blokują replikację HIV, zapobiegając wewnątrzkomórkowemu uwalnianiu wirusowego białka nukleokapsydowego [28], efekt jest niezależny od katalitycznej aktywności PLA2. Jednak w przypadku ludzkich PLA2 wykazano aktywność przeciwwirusową przeciwko Lentiwirusom [29], która zależała od funkcji katalitycznej i pośredniczyła w niszczeniu błony wirusowej.

W tym badaniu, aby wyjaśnić rolę aktywności fosfolipolitycznej w działaniu przeciwwirusowym, przeanalizowaliśmy działanie kilku węży PLA2 przeciwko HIV. Stwierdzono, że mechanizmy działania przeciwwirusowego badanych PLA2 były podobne do działania PLA2 ssaków, ale różniły się od wcześniej odkrytych mechanizmów PLA2 pszczół i węży. Nasze wyniki wskazują, że WĘŻE PLA2 są zdolne do hamowania tworzenia się syncytu między komórkami przewlekle zakażonymi HIV a zdrowymi komórkami CD4-dodatnimi i blokują wiązanie HIV z komórkami. Jednak tylko dimeryczne PLA2 miały wyraźną aktywność wirusobójczą i anty-HIV, która zależała od ich aktywności katalitycznej. Zdolność węży PLA2 do inaktywacji wirusa stanowi nowy mechanizm obronny, który może stanowić dodatkową barierę dla zakażenia HIV.

2. Wyniki

2.1. PLA2 z jadu węża

W tym badaniu wykorzystano kilka jadów węża PLA2 i ich podjednostki. Dwa PLA2 z grupy IA wyizolowano z jadu krait Bungarus fasciatus: BF-PLA2-1 (zasadowa fosfolipaza A2 1; UniProtKB Q90WA7) i BF-PLA2-II (fosfolipaza A2 II; GenBank AAK62361.1). Inne wykorzystane PLA2 pochodziły z grupy IIA: Vur-PL2 (UniProtKB F8QN53) z żmii Vipera ursinii renardi oraz HDP-1 i HDP-2 z żmii V. nikolskii. Dwa ostatnie dimery składały się odpowiednio z podjednostek HDP-1P (UniProtKB Q1RP79) i HDP-2P (UniProtKB Q1RP78), posiadających aktywność fosfolipolityczną, w połączeniu z nieaktywnym HDP-1I (UniProtKB A4VBF0) wspólnym dla obu dimerów. HDP-2P i HDP-1I otrzymano z HDP-2 za pomocą chromatografii z odwróconą fazą. Aktywność fosfolipolityczna BF-PLA2-II została zablokowana przez leczenie bromkiem 4-bromofenacylu, który selektywnie alkiluje jego pozostałość w miejscu aktywnym. Podobne traktowanie HDP-2P spowodowało nieaktywną wersję HDP-2P (zwaną HDP-2Pinact). Analiza spektrometrii mas ujawniła włączenie jednej pozostałości 4-bromofenacylu do cząsteczki HDP-2Pinact. Aktywność fosfolipolityczna HDP-2Pinact zmniejszyła się około 2200-krotnie (ryc. S1).

2.2. Działanie antyretrowirusowe PLA2 jadu węża

Działanie przeciwwirusowe różnych PLA2 oceniano w odniesieniu do szczepu referencyjnego HIV-1 IIIB przy użyciu komórek MT-4. Grupy monomeryczne IA BF-PLA2-II i BF-PLA2-1 nie wykazały aktywności przeciwko HIV-1 (ryc. 1A). Monomeryczny Vur-PL2 (grupa IIA) wykazywał umiarkowaną aktywność przeciwko HIV-1 IIIB, hamując zakażenie o ~ 50% przy 100 μg / ml. Stwierdzono, że dimeryczne PLA2 HDP-1 i HDP-2 hamują replikację HIV-1 IIIB przy wartościach IC50 wynoszących odpowiednio 0,67 (24,8 nM) i 0,28 μg / ml (9,2 nM) (rycina 1A, B i tabela 1). Wszystkie badane PLA2 nie wykazały cytotoksyczności w stosunku do komórek MT-4 w stężeniu do 100 μg / ml (37 μM, dane nie pokazano).

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is ijms-23-01610-g001.jpg

Działanie przeciwwirusowe PLA2 przeciwko HIV-1 IIIB. PLA2 w różnych stężeniach dodano do komórek MT-4, a następnie zaszczepiono HIV-1 w 100 TCID50 (pięćdziesiąt procent dawki infekującej kulturę tkankową). Hamowanie działania cytopatycznego (CPE) określono za pomocą testu bromku metylotiazolilodifenylo-tetrazoliowego (MTT) 5 dni po zakażeniu. (A) Aktywność pięciu badanych PLA2 przeciwko CPE indukowane przez HIV. (B) Przeciwwirusowa aktywność dimerycznej HDP-2 i jej podjednostek przeciwko HIV-1. Wyniki są reprezentatywne dla co najmniej trzech niezależnych eksperymentów ze średnią ± SEM.

Tabela nr 1

Wartości IC50 dla dimerycznych PLA2 HDP-2 i jego podjednostek.

MT-4/HIV-1 IIIB IC50 (μg/ml) z 95% CI *
HDP-2 0.25 (0.18–0.35)
HDP-2P 0.0008 (0.0005–0.001)
HDP-2I >10
HDP-2Pinact 0.1 (0.04–0.3)

* CI: przedziały ufności.

Aby zbadać, czy aktywność katalityczna PLA2 jest wymagana do działania hamującego, badano enzymatycznie aktywną podjednostkę HDP-2P (z dimerycznej HDP-2) i enzymatycznie nieaktywne podjednostki HDP-1I i HDP-2Pinact. Enzymatycznie aktywny HDP-2P znacznie hamował replikację HIV-1, a jego aktywność była 30 razy wyższa niż w przypadku dimerycznego HDP-2 (ryc. 1B i tabela 1). HDP-1I wykazał bardzo słabą aktywność przeciwko HIV-1 (ryc. 1B). Hamowanie aktywności enzymatycznej HDP-2P (powodując HDP-2Pinact) doprowadziło do znacznego zmniejszenia działania przeciwwirusowego (ponad dwa rzędy wielkości w porównaniu do HDP-2P), ale ta inaktywowana podjednostka była około trzy razy bardziej aktywna niż dimeryczna HDP-2 (ryc. 1B i Tabela 1).

Aktywność przeciwwirusową dimerycznej PLA2 HDP-2, a także dwóch monomerycznych Vur-PL2 i BF-PLA2-II, badano przy użyciu panelu laboratoryjnych wysoce patogennych szczepów HIV-1 różnych podtypów: wariantu HIV-2 EHO i zakaźnych klonów molekularnych (K3016 i AD8). Stwierdzono, że HDP-2 silnie hamuje wszystkie warianty HIV (ryc. 2 i tabela 2). Wartości IC50 dla tego PLA2 mieściły się w zakresie 0,9–0,09 μg/ml. Monomeric PLA2 Vur-PL2 wykazał niską aktywność przeciwko szczepom HIV-1 MvP-899, HIV-1 Zmb i HIV-2 EHO w maksymalnym stężeniu stosowanym w eksperymentach (100 μg / ml) (Ryc. 2A, B, D). Jednak zarówno Vur-PL2, jak i BF-PLA2-II były w stanie prawie całkowicie zahamować replikację zakaźnych klonów molekularnych K3016 i AD8 (rysunek 2E, F i tabela 2).

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is ijms-23-01610-g002.jpg

Przeciwwirusowa aktywność PLA2 przeciwko różnym szczepom i klonom molekularnym HIV. (AD) PLA2 w różnych rozcieńczeniach dodano do komórek MT-4; po czym komórki zostały zakażone odpowiednim szczepem HIV przy 100 TCID50. Hamowanie CPE określono po 48–72 h zakażenia metodą MTT. (E,F) Hamowanie replikacji zakaźnych klonów molekularnych za pomocą PLA2 określono na komórkach TZM-bl po 48 h zakażenia aktywnością genu reporterowego β-Gal. Dane są średnią ± SEM (n = 3).

Tabela nr 2

Wartości IC50 dla trzech badanych PLA2 w różnych systemach wirusowo-komórkowych.

System komórkowy/wirusowy IC50 (μg/ml) z 95% CI *
HDP-2 Vur-PL2 BF-PLA2-II
MT-4/HIV-1 MvP-899 0.1 (0.006–0.01) – **
MT-4/HIV-1 Zmb 0.22 (0.15–0.32) 16.45 (3.9–68.1)
MT-4/HIV-1 U455 0.9 (0.32–2.6)
MT-4/HIV-2 EHO 0.016 (0.008–0.03) ~10,41
TZM-bl/HIV-1 K3016 0.009 (0.006–0.015) 4.37 (3.2–5.9) ~12,21
TZM-bl/HIV-1 AD8 0.046 (0.037–0.057) 10.29 (8.8–11.9) ~14,26

* CI: przedziały ufności; **: nie wykryto.

Działanie przeciwwirusowe PLA2 zostało następnie przetestowane na komórkach docelowych TZM-bl poprzez pomiar zwiększenia aktywności genu reporterowego β-Gal przez pseudowirusy HIV-1, reprezentujące podtyp A6 i rekombinowaną postać CRF02_AG / A6. Wszystkie badane PLA2 wykazały wysoką aktywność przeciwko pseudowirusowi HIV-1 reprezentującemu podtyp A6 (ryc. 3A). Działanie przeciwwirusowe PLA2 było znacznie zmniejszone podczas testowania przeciwko pseudowirusowi HIV-1, reprezentującemu rekombinowaną postać CRF02_AG / A6 (ryc. 3B i Tabela 3).

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is ijms-23-01610-g003.jpg

Aktywność przeciwwirusowa różnych PLA2 przeciwko pseudowirusom HIV-1. Różne stężenia PLA2 dodano do komórek docelowych TZM-bl i transdukowano za pomocą pseudotypowych wirionów HIV-1, reprezentujących (A) podtyp A6 lub (B) rekombinowaną postać CRF02_AG/A6. Zakaźność oceniano za pomocą aktywności genu reporterowego β-Gal po 48 godzinach zakażenia. Dane są średnią ± SEM z potrójnych.

Tabela nr 3

Wartości IC50 dla czterech PLA2 badanych w systemach pseudowirusowych.

PLA2 IC50 (μg/ml) z 95% CI *
HIV-1 A6 HIV-1 CRF02_AG/A6
HDP-1 0.009 (0.008–0.01) 0.046 (0.038–0.056)
HDP-2 0.008 (0.007–0.009) 0.04 (0.034–0.047)
Vur-PL2 0.007 (0.006–0.01) 0.1 (0.07–0.16)
BF-PLA2-II 3.22 (1.78–5.84) ~31,75

* CI: przedziały ufności.

2.3. Wpływ PLA2 na tworzenie się synkitu w kokulturach komórek HIV-1 przewlekle zakażonych i sup-T1

Zakażone HIV-l komórki H9 / HIV-1 IIIB, H9 / HIV-1 RF i CEM / HIV-1 Bru zostały wykorzystane jako komórki indukujące do tworzenia syncytu. Niezainfekowane komórki SUP-Tl CD4 + wykorzystano jako komórki docelowe. Spośród wszystkich badanych PLA2 tylko dimeryczne HDP-1 i HDP-2 wykazywały wysoką aktywność, zależną od dawki hamującą tworzenie się syncytu komórek przewlekle zakażonych różnymi szczepami HIV-1 (ryc. 4). Monomeric Vur-PL2 wykazał aktywność w blokowaniu fuzji komórek indukowanej przez komórki bru CEM / HIV-1 (ryc. 4A), ale nie zaobserwowano aktywności dla innych komórek przewlekle zakażonych HIV-1. PLA2 BF-PLA2-II i BF-PLA2-1 wykazały wysoką aktywność przy 100 μg/ml dla wszystkich systemów komórkowych (ryc. 4A–C). Jednak po leczeniu BF-PLA2-II bromo-bromofenacylu bromku, który jest skutecznym inhibitorem PLA2, zaobserwowano silny spadek hamowania tworzenia syncytu przy użyciu komórek H9/HIV-1 IIIB (ryc. 4D). Spośród trzech badanych szczepów HIV, HIV-1 IIIB zachował najwyższą zdolność do indukowania tworzenia syncytu w obecności PLA2.

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is ijms-23-01610-g004.jpg

Wpływ PLA2 na tworzenie syncytu. Komórki Sup-T1 i komórki przewlekle zakażone HIV-1 mieszano i leczono PLA2. Poziomy fuzji komórek oszacowano po 24 godzinach pod mikroskopem. Hamowanie tworzenia syncytu przez PLA2s wykazano dla (A) komórek CEM zakażonych HIV-1 Bru, (B) komórek H9 zakażonych HIV-1 RF i (C) komórek H9 zakażonych HIV-1 IIIB. (D) Zablokowanie aktywności enzymatycznej BF-PLA2-II spowodowało zmniejszenie hamowania tworzenia się syncytu przez komórki H9 zakażone HIV-1 IIIB. Dane reprezentują średnią ± SEM z trzech niezależnych eksperymentów. Test t studenta: *** p < 0,001, ns p > 0,05.

2.4. Dimeryczne PLA2 mają aktywność wirusobójczą i blokują adsorpcję HIV-1

Przetestowaliśmy możliwą bezpośrednią aktywność wirusobójczą dimerycznego HDP-2 przeciwko HIV-1. W tym celu HIV-1 IIIB inkubowano z różnymi stężeniami HDP-2 lub pożywki kontrolnej w temperaturze 37 °C przez 1 h, a następnie rozcieńczano poniżej IC50 i inokulowano do komórek MT-4 metodą ograniczonego rozcieńczania. Wyniki pokazały, że HDP-2 skutecznie neutralizował zakaźność HIV-1 w sposób zależny od dawki (ryc. 5A). Znaczące zahamowanie replikacji HIV-1 zaobserwowano, gdy wirus był leczony stężeniem HDP-2 100 (37 μM) i 10 μg / ml (3,7 μM).

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is ijms-23-01610-g005.jpg

Wirusobójcze działanie HDP-2 i blokowanie adsorpcji HIV-1. (A) Stado HIV-1 leczono różnymi stężeniami HDP-2, a następnie stosowano do infekowania komórek MT-4 przez 5 dni. Działanie przeciwwirusowe HDP-2 oceniano poprzez określenie miana wirusa na podstawie CPE. Dane reprezentują środki ± SEM dla trzech niezależnych eksperymentów. Jednokierunkowa ANOVA z testem post hoc Tukeya: * p ˂ 0,05 i ** p ˂ 0,01. (B) Hamujące działanie HDP-2 i jego podjednostek na wiązanie HIV-1 IIIB z komórkami MT-4. Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM (n = 3).

Dodatkowo w teście adsorpcji wirusa analizowano aktywność HDP-2 i jego podjednostek przeciwko HIV-1. Komórki MT-4 były zakażone HIV-1 IIIB przez dwie godziny w obecności różnych rozcieńczeń PLA2 lub PBS jako kontroli; po czym wewnątrzkomórkowe stężenie antygenu HIV-1 p24 określono za pomocą testu ELISA. Nieaktywna enzymatycznie podjednostka HDP-1I wykazała słabą aktywność w hamowaniu adsorpcji HIV-1. Jednak HDP-2, a także jego katalityczna podjednostka HDP-2P, blokowały wiązanie wirusa z komórkami równie skutecznie (ryc. 5B).

2.5. Synergistyczne działanie HDP-2 i nukleozydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy HIV (NRTI)

Testowaliśmy kombinacje HDP-2 z lamiwudyną (3TC) lub fumaranem dizoproksylu tenofowiru (TDF) przeciwko CPE za pośrednictwem HIV-1 w komórkach MT-4. Różne stężenia związków samych lub w kombinacjach dodawano do niezakażonych lub zakażonych wirusem komórek. CPE wywołany HIV mierzono po 48 godzinach w celu określenia synergii związku. Nasze dane wykazały, że kombinacja HDP-2/3TC i HDP-2/TDF tłumiŁA CPE za pośrednictwem HIV-1 z wynikami synergii odpowiednio 12,9 i 24,5 (Rycina 6). Tak więc dwie badane kombinacje leków wykazały wyraźną synergię, z wyższym wynikiem synergii dla kombinacji HDP-2 / TDF.

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is ijms-23-01610-g006.jpg

Kombinacje HDP-2 z (A) 3TC lub (B) TDF hamują CPE za pośrednictwem HIV-1 w komórkach MT-4. Krajobrazy interakcji kombinacji leków przedstawiono jako matryce dawka-odpowiedź. Pokazano rozkład synergii i krajobrazy synergii 3D. Najbardziej synergiczny obszar jest wyświetlany na macierzach.

3. Dyskusja

We współczesnej klasyfikacji istnieją dwa główne typy HIV, a mianowicie HIV-1 i HIV-2. Wirusy te prawdopodobnie powstały w wyniku niezależnej transmisji SIV (Simian Immunodeficiency Virus) na ludzi odpowiednio przez szympansy i mangabeys [1]. Wiadomo, że HIV-2 jest mniej patogenny i mniej podatny na przenoszenie niż HIV-1. Gatunek HIV-1 jest klasyfikowany do głównej grupy M i kilku grup pomocniczych. Uważa się, że grupy M, N, O i P powstały w wyniku niezależnych przypadków przenoszenia SIV z małp na ludzi i późniejszej mutacji wirusa do HIV. Wirusy grupy M (z angielskiego „Main”) są przyczyną ponad 90% zakażeń HIV. Grupa M jest klasyfikowana do kilku kladów, zwanych podtypami, również oznaczonych literami. Na przykład podtyp A jest szeroko rozpowszechniony w Afryce Zachodniej i Rosji. Podtypy HIV zmieniają się dynamicznie, stwarzając wyzwania dla diagnostyki i leczenia, a także dla projektowania i rozwoju szczepionek [30].

Wykazano wcześniej, że PLA2 posiadają działanie hamujące przeciwko wirusowi HIV. Pierwsze badanie pojawiło się ponad 20 lat temu i wykazało, że cztery wydzielnicze PLA2 z jadów zwierzęcych były bardzo silnymi inhibitorami HIV-1 [28]. Nie stwierdzono wpływu PLA2 na wiązanie wirusa z komórkami lub na tworzenie synchytii, a aktywność katalityczna PLA2 nie wykazała udziału w działaniu przeciwwirusowym. Autorzy założyli, że aktywność przeciwwirusowa obejmowała specyficzną interakcję PLA2 z komórkami gospodarza. Później odkrycie to zostało poparte danymi dla izoformy CM-II wydzielanego PLA2 uzyskanego z jadu węża Naja mossambica mossambica [25].

Jednak w przeciwieństwie do tych wyników, stwierdzono, że wydzielniczy ludzki sPLA2-X zneutralizował HIV-1 poprzez degradację błony wirusowej. Aktywność przeciwwirusowa PLA2 zależała od funkcji katalitycznej, a komórki docelowe infekcji pozostały nienaruszone [29]. Ponadto w osoczu pacjenta zidentyfikowano PLA2 grupy IB (PLA2G1B); PLA2G1B synergizował z białkiem otoczki HIV gp41, a para PLA2G1B / gp41 indukowała brak reakcji limfocytów T CD4 + (anergia) [31].

W naszej pracy staraliśmy się dowiedzieć, w jaki sposób wąż PLA2 działa na HIV lub jego komórki docelowe. Jak wspomniano powyżej, HIV-1 jest niezwykle adaptacyjny i zróżnicowany, a jego rekombinowane formy krążące pojawiły się niedawno, które również badano w tej pracy. Poza tym rozszerzyliśmy zakres badanych PLA2. Badane wcześniej jady węża PLA2 obejmowały głównie te z podrodziny D49 z grupy I: NmmCMIII z N. mossambica mossambica, OS1 i taipoxin z Oxyuranus scutellatus scutellatus, nigexine z N. nigricollis [28] i izoforma CM-II z N.m. mossambica [25]. Ponadto badano jad pszczeli PLA2 z grupy III i białko podobne do BaIV PLA2 z Bothrops asper z podrodziny K49 z grupy II [28]. W naszej pracy wykorzystaliśmy dimeryczne fosfolipazy HDP-1 i HDP-2 oraz ich podjednostki HDP-1I i HDP-2P od V. nikolskiego, a także Vur-PL2 od V. ursinii renardi; wszystkie te PLA2 pochodzą z podrodziny D49 z grupy II. Ponadto badaliśmy BF-PLA2-1 i BF-PLA2-II z krait B. fasciatus. Chociaż te PLA2 należą do podrodziny D49 z grupy I, pochodzą od węża z rodzaju Bungarus, który jest zupełnie inny niż badany wcześniej rodzaj Naja.

Oceniliśmy zdolność PLA2 jadu węża do hamowania replikacji HIV-1 i stwierdziliśmy, że dimeryczne PLA2 wykazują wysoką aktywność przeciwwirusową zarówno przeciwko dzikiemu typowi HIV-1, jak i pseudowirusom różnych podtypów. Badane PLA2 są zdolne do hamowania różnych podtypów HIV-1 na różne sposoby. Zaobserwowano wysokie działanie przeciwwirusowe przeciwko podtypowi A6, podczas gdy znaczny spadek aktywności przeciwwirusowej zaobserwowano dla rekombinowanej postaci CRF02_AG/A6. Takie rozróżnienie można wytłumaczyć różnicami w strukturach glikoprotein wirionowych, różnym stopniem glikozylacji lub zmianami w składzie błony wirusowej. Wcześniej informowano [32], że HIV-1 może uniknąć hamującego działania PLA2 poprzez wybranie specyficznej glikoproteiny otoczki (obecność rzadkich mutacji w regionie N-końcowym i rozszerzeniach pętli otoczki V1-V2), co pozwoliło wirusowi zainfekować komórki za pośrednictwem alternatywnej ścieżki wejścia w oparciu o transfer endosomów. Tak więc obserwowane różnice w działaniu przeciwwirusowym PLA2, wykryte na pseudowirusach dwóch różnych podtypów, mogą również wynikać z obecności mutacji w glikoproteinach HIV-1. Jednak dimeryczny PLA2 HDP-2 wykazał szerokie spektrum działania anty-HIV przeciwko wirusom różnych podtypów i posiadającym różne tropizmy koreceptorów.

W poprzednich badaniach wykazano, że PLA2 wyizolowany z jadu Crotalus durissus terrificus ma silną aktywność przeciwwirusową przeciwko wirusowi dengi (DENV-2) i wirusowi żółtej febry (YFV) w teście wirusobójczym, dostarczając przekonujących dowodów na bezpośrednie działanie na cząstkę wirusa [26,33]. W naszej ostatniej pracy wykazaliśmy, że dimeryczny HDP-2 wyizolowany ze żmii V. nikolskii posiadał silne działanie wirusobójcze, które były związane z jego aktywnością fosfolipolityczną i hamował fuzję komórka-komórka, w której pośredniczyła glikoproteina kolca SARS-CoV-2 [34]. Tutaj również znaleźliśmy bezpośrednie działanie wirusobójcze HDP-2, które potwierdziło zdolność PLA2 do inaktywacji różnych wirusów. Hamowanie wirusów jest najprawdopodobniej spowodowane aktywnością enzymatyczną PLA2, która opiera się na hydrolizie wiązania estru sn-2-acylowego glicerofosfolipidów sn-3, wytwarzając kwasy tłuszczowe i lizofosfolipidy [35]. Hydroliza fosfolipidów glicerolu może prowadzić do degradacji otoczki wirusowej, co doprowadzi do utraty zakaźności wirionów i ich zdolności do infekowania komórek.

Zgłoszono kilka sPLA2, w tym z jadów pszczół i węży, w celu ochrony pierwotnych limfocytów ludzkiej krwi przed replikacją różnych makrofagów i tropic HIV-1 komórek T [28]. Stwierdzono jednak, że sPLA2 hamowały HIV-1 nie poprzez działanie wirusobójcze. Nie stwierdzono wpływu ani na wiązanie wirusa z komórkami, ani na tworzenie synchnicy, a aktywność katalityczna sPLA2 nie była zaangażowana w działanie przeciwwirusowe. W przeciwieństwie do tego, odkryliśmy, że aktywność enzymatyczna węża PLA2 analizowana w naszej pracy jest niezbędna dla działania przeciwwirusowego. Hamowanie aktywności enzymatycznej podjednostki katalitycznej HDP-2P, pochodzącej z dimerycznej HDP-2, doprowadziło do gwałtownego spadku aktywności anty-HIV. To odkrycie jest zgodne z poprzednim raportem, pokazującym, że ludzki sPLA2-X ma działanie przeciwwirusowe przeciwko lentiwirusom ze względu na jego funkcję katalityczną i rozpoznawanie otoczki wirusowej [29]. Rozbieżności w wynikach przedstawionych wcześniej [28] i naszych mogą wynikać z różnic w metodologii i projekcie eksperymentalnym. W cytowanej pracy [28] do określenia właściwości przeciwwirusowych PLA2 wykorzystano jednorundowe testy infekcji, podczas gdy my użyliśmy zakaźnych wirusów do infekcji wielocyklowej. Aby ocenić aktywność wirusobójczą, w Referencji [28] użyto tylko jadu pszczelego PLA2 należącego do grupy III, podczas gdy PLA2 z grup I i II wykorzystano w naszej pracy. To samo dotyczy wiązania wirusa z komórką i tworzenia syndykcji. Jeśli chodzi o rolę aktywności katalitycznej, ponownie badano wpływ leczenia tylko jadu pszczelego PLA2 inhibitorami [28]. Ponadto nie podano danych dotyczących aktywności fosfolipolitycznej hamowanego PLA2. Ponieważ PLA2 grupy III z jednego miejsca oraz grupy I i II PLA2 z innych miejsc różnią się znacznie strukturą i specyficznością substratu, jest całkiem możliwe, że mechanizm molekularny leżący u podstaw działania przeciw HIV jest różny dla tych grup.

Nasze wyniki pokazują, że hamowanie PLA2 HIV-1 występuje na wczesnym etapie cyklu replikacji wirusa. HIV dostaje się do komórki poprzez fuzję w błonie plazmatycznej, proces wywołany przez wiązanie gp120 z receptorami CD4 i chemokiny. Uzyskane dane pokazują, że wiązanie gp120 z tymi receptorami komórkowymi jest hamowane przez PLA2, ponieważ wszystkie badane PLA2 wykazywały aktywność w hamowaniu tworzenia syncytu w systemie kokultywacji przewlekle zakażonych komórek HIV-1 komórkami CD4 + Sup-T1. Ponadto odkryliśmy, że dimeryczny HDP-2, a także jego enzymatycznie aktywna podjednostka HDP-2P, są zdolne do hamowania wiązania HIV-1 z komórkami. Podobne dane zostały pokazane wcześniej dla surowych jadów C. d. terrificus i izolowanych toksyn, takich jak krotoksyna, PLA2-CB i PLA2-IC, które hamowały adsorpcję zarówno YFV, jak i DENV-2 [33]. Co ciekawe, PLA2 wyizolowane z jadu pszczelego nie wykazały hamującego wpływu na tworzenie syncytu, co sugeruje, że PLA2 pszczół nie działają na proces fuzji wirus-komórka [28]. Jednak syntetyczne peptydy pochodzące z jadu pszczelego PLA2 były w stanie hamować replikację HIV-1 i tworzenie syncytu poprzez interakcję z koreceptorem komórkowym CXCR4, co może być spowodowane obecnością sekwencji homologicznych w PLA2 i glikoproteinach otoczki wirusowej [36].

4. Materiały i metody

4.1. Komórki i wirusy

Ludzkie limfocyty T H9, MT-4, Sup-T1 (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, ARRRP, Manassas, VA, USA) i CCRF-CEM (CCL-119, ATCC, Manassas, VA, USA) były uprawiane w kompletnej pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1× piórem / paciorkowcem i 1× GlutaMAX (wszystkie z Gibco RBL Life Technologies, Waltham, MA, USA). HIV-1 IIIB, HIV-1 RF i HIV-1 Bru uzyskano z ARRRP. Przewlekle zakażone komórki H9 / HIV i CEM / HIV zostały przygotowane przez wystawienie kultur komórek H9 lub CCRF-CEM na HIV-1 IIIB, HIV-1 RF lub HIV-1 Bru przez 4 tygodnie. Trwałą produkcję wirusa oceniano za pomocą antygenu HIV-1 p24 ELISA (Vektor-Best, Nowosybirsk, Rosja). Komórki 293T (ATCC, CRL-3216) i TZM-bl (stabilnie wyrażające CD4 i CXCR4, a także CCR5 i zawierające regulowane przez HIV-1 geny reporterowe dla lucyferazy i β-galaktozydazy (ARRRP) były hodowane w kompletnej pożywce DMEM (Gibco RBL Life Technologies, Waltham, MA, USA). Zapasy wirusa przygotowano z supernatantu ostrych zakażonych komórek MT-4 lub CCRF-CEM.

W niektórych eksperymentach wykorzystano następujące szczepy wirusa: HIV-1 Zmb (Clade B, Białoruś) [37], HIV-1 U455 (Clade A, Uganda) [38] i HIV-1 MvP-899 (Clade B, Niemcy) [38]. Molekularny klon HIV-1 K3016 (klad C) przenoszony przez wirus założycielski i AD8 (R5-tropic) uzyskano przez ARRRP i wygenerowano przez transfekcję komórek 293T [39].

4.2. Fosfolipazy A2

Fosfolipazę A2 Vur-PL2 (UniProtKB F8QN53) o aktywności enzymatycznej 3,6 mmol/min/mg otrzymano z opisanego jadu żmii V. ursinii renardi [40]. Fosfolipaza A2 1 (BF-PLA2-1, UniProtKB Q90WA7) i fosfolipaza A2 II (BF-PLA2-II, GenBank AAK62361.1) zostały wyizolowane z jadu krait Bungarus fasciatus zgodnie z opisem [23]. Dimeryczne fosfolipazy HDP-1 i HDP-2 zostały oczyszczone z jadu żmii V. nikolskii i rozdzielone na podjednostki HDP-1I (UniProtKB A4VBF0), HDP-1P (UniProtKB Q1RP79) i HDP-2P (UniProtKB Q1RP78) zgodnie z opisem [21]. Wykazano, że HDP-1I był enzymatycznie nieaktywny; HDP-1P i HDP-2P mają wyższą aktywność enzymatyczną (odpowiednio 1,25 i 0,81 mmol / min / mmol białka) niż HDP-1 (0,56 mmol / min / mmol) i HDP-2 (0,31 mmol / min / mmol) [21]. W celu otrzymania inaktywowanego HDP-2P do roztworu 20-μM HDP-2P do roztworu 20-μM HDP-2P w 50-mM buforze Tris HCl (pH 7,5) zawierającym 10-mM Na2SO4 dodano roztwór bromku bromku 4 4 bromku bromku 4 bromku 4 bromku 4 bromku 4. Po inkubacji przez 6 godzin w temperaturze pokojowej mieszaninę oddzielono na kolumnie JUPITER C18 HPLC (Phenomenex, Torrance, CA, USA) przy użyciu gradientu acetonitrylu od 20 do 50% w ciągu 30 minut w obecności 0,1% kwasu trifluorooctowego. Aktywność fosfolipolityczną określono za pomocą syntetycznego substratu fluorescencyjnego 1-palmitoilo-2-(10-pirenylodecanoilo)-sn-glicero-3-fosfocholiny (Molecular Probes, Waltham, MA, USA) (według Radvanyi et al. [41]) i spektrofluorometru Hitachi F-4000 (Hitachi, Tokio, Japonia).

Inaktywację aktywności enzymatycznej BF-PLA2-II przeprowadzono w sposób opisany wcześniej [42]. Krótko mówiąc, 3 mg BF-PLA2-II rozpuszczono w 1 ml buforu 0,1-M Tris i 0,7 mM EDTA (pH 8,0). Następnie dodano bromek 4-bromofenacylu (1,5 mg/ml w etanolu, o końcowym stężeniu 0,2 mg/ml) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 24 h.

4.3. Test antyretrowirusowy

Testy anty-HIV zostały wykonane zgodnie z opisem wcześniej [43]. Krótko mówiąc, komórki MT-4 (2 × 104 /dołek) zostały wysiane w płytkach 96-dołkowych. Następnie zawiesinę komórkową mieszano z odpowiednim roztworem PLA2 (tj. końcowymi stężeniami 100, 10, 1, 0,1, 0,01 i 0,001 μg / ml) i zakażono HIV-1 IIIB po 100-krotności dawki infekcyjnej 50% hodowli komórkowej (CCID50). Po 5 dniach żywotność komórek pozorowanych, leczonych PLA2 i zakażonych HIV zbadano spektrofotometrycznie za pomocą testu bromku metylotiozolilodifenylo-tetrazoliowego (MTT). 50% stężenie hamujące (IC50) wymagane do zapobiegania efektowi cytopatycznemu wywołanemu HIV (CPE) zostało określone przez analizę regresji przy użyciu GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

4.4. Test tworzenia synkitu

Test syncytium przeprowadzono poprzez współkultywację równych liczb (8 × 104) przewlekle zakażonych komórek H9 / HIV-1 IIIB, H9 / HIV-1 RF lub CEM / HIV-1 Bru z komórkami CD4 + Sup-T1 w płytkach 96-dołkowych w obecności różnych stężeń PLA2. Po 24 godzinach kokultywacji tworzenie się syncytu oceniano wizualnie pod mikroskopem.

4.5. Oznaczenie wirusobójcze

Zapasy zakaźnego HIV-1 IIIB mieszano z różnymi stężeniami PLA2 i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Próbki rozcieńczono 5000 razy kompletną pożywką RPMI 1640, aby osiągnąć stężenie PLA2 poniżej IC50. Następnie zakaźność HIV-1 IIIB określono przez miareczkowanie na komórkach MT-4. Po 5 dniach komórki obserwowano pod mikroskopem, a wartość CCID50 obliczono metodą Reeda i Muencha [44].

4.6. Test adsorpcji wirusów

W tym teście zmierzono hamujące działanie PLA2 (HDP-2, HDP-2P i HDP-2I) na adsorpcję wirusa HIV-1 IIIB do komórek MT-4, jak wcześniej opisano [45]. Komórki MT-4 (106 komórek/ml) inkubowano z HIV-1 w dawce 1000 CCID50 w przypadku braku lub obecności seryjnych rozcieńczeń PLA2. Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C komórki przemyto PBS w celu usunięcia niewchłoniętego wirusa. Następnie komórki zostały zlizowane PBS zawierającym 0,01% Triton X-100. Ilość antygenu p24 została określona przez antygen HIV-1 p24 ELISA (Vektor-Best, Nowosybirsk, Rosja).

4.7. Budowa i produkcja klonów funkcjonalnych HIV-1 Env

Budowę pseudowirionów HIV-1 wykonano w sposób opisany wcześniej [46]. Krótko mówiąc, RNA wyizolowane z próbek surowicy pacjentów zakażonych HIV zostało początkowo wzmocnione przez reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) i zsekwencjonowane we fragmentach odpowiadających proteazie kodującej genom HIV-1 i odwrotnej transkryptazie [47]. Wirusy podtypu A6 i CRF02_AG/A6 wybrano do amplifikacji i klonowania genów otoczki (env). Amplifikowane fragmenty pełnowymiarowego genu env zostały wyekstrahowane z żelu agarozowego za pomocą zestawu MinElute Gel Extraction (Qiagen, Valencia, CA, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Aby przygotować plazmid ekspresji rev/env, otrzymane DNA zostało podwiązane w wektorze ekspresji pcDNA3.1/V5-His-TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

Env-pseudowirusy otrzymano przez transfekcję komórek 293T (5 × 106 komórek w 10 ml pożywki wzrostowej na 100-milimetrowej szalce Petriego) z 4 μg plazmidu ekspresji rev/env i 8 μg wektora szkieletowego HIV-1 z niedoborem env (pSG3Δenv) przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA), zgodnie z opisem producenta. Po 48 godzinach supernatanty kultur zawierające pseudowirusy zostały zebrane, przefiltrowane (0,45 μM) i przechowywane w temperaturze −80 °C w podwielokrotnościach 1 ml. Zasoby wirusa pseudotypowego Env zostały miareczkowane zgodnie z opisem wcześniej [48]. Krótko mówiąc, komórki TZM-bl zostały zasiane w 96-dołkowej płytce i zainfekowane 10-krotnym seryjnym rozcieńczeniem zapasów wirusa. Po 48 h infekcji wirusowej komórki utrwalono w 0,1% paraformaldehydzie przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie komórki przemyto trzykrotnie PBS i zabarwiono roztworem barwiącym zawierającym 400 μg/ml X-galu (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozydu), 4-mM MgCl2, 4-mM żelazocyjanku potasu i 4-mM żelazicyjanku potasu w PBS przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Zabarwione na niebiesko kolonie zostały następnie zwizualizowane i policzone pod mikroskopem.

4.8. Test wrażliwości na leki przeciwko klonom funkcjonalnym HIV-1 Env

Wrażliwość na hiv-1 określono za pomocą enzymatycznego testu aktywności β galaktozydazy przy użyciu komórek TZM-bl wykazujących ekspresję CD4 i koreceptorów CXCR4 i CCR5. W tym celu komórki TZM-bl zostały wysiane w płytkach 96-dołkowych (104 / dołek) dzień przed eksperymentem. Następnie do komórek dodano różne stężenia PLA2, a następnie zaszczepiono pseudowirusami HIV-1 w 500 jednostkach tworzących niebieskie komórki (BFU) / well. Po 48 godzinach inokulacji HIV-1 komórki zostały zlizowane PBS zawierającym 1% Triton-X100 i inkubowane w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z 10-mM chlorofenolem czerwono-β-D-galaktopiranozydem (CPRG; Sigma, St. Louis, MO, USA) w 2-mM MgCl2 i 100-mM KH2PO4. Reakcję zatrzymano przez dodanie 0,5-M Na2CO3. Gęstość optyczną przy 570 nM mierzono na czytniku mikropłytek (Hidex Sense Beta Plus, Hidex, Turku, Finlandia). Określono stężenia leków, które przyniosły około 50% zahamowania aktywności β-galaktozydazy.

4.9. Analiza kombinacji leków i synergii

Kombinowana aktywność hamująca PLA2 HDP-2 i lamiwudyny (3TC) lub fumaranu dizoproksylu tenofowiru (TDF) przeciwko HIV-1 została przeanalizowana przy użyciu modelu referencyjnego Zero Interaction Potency (ZIP) przez SynergyFinder wersja 2 [49]. Komórki MT-4 leczono różnymi stężeniami PLA2 i odpowiadającego mu leku i zakażono HIV-1 IIIB (100 TCID50) lub próbą. Po 72 godzinach pomiar CPE wywołanego wirusem mierzono metodą MTT. Procent hamowania HIV-1 wynikający z połączenia HDP-2/3TC lub HDP-2/TDF oceniano pod kątem synergistycznego działania na podstawie wyników synergii z macierzy dawka-odpowiedź.

5. Wnioski

Nasze dane wykazały, że dimeryczne PLA2 mogą hamować replikację HIV-1 z dużą mocą. Jednak nowe szczepy (formy) HIV-1, jak wynika z naszej obecnej pracy, były mniej wrażliwe na efekty PLA2. Destrukcyjny wpływ PLA2 na błonę wirusową potwierdzono za pomocą testu wirusobójczego. PLA2 może wywierać bezpośredni wpływ na cząstki wirusa, najprawdopodobniej z powodu rozszczepienia glicerofosfolipidów na otoczce wirusowej, co może prowadzić do zniszczenia dwuwarstwy lipidowej i destabilizacji wirusa. Ponadto PLA2 HDP-2 hamuje wczesne stadia cyklu replikacji HIV-1, co zostało potwierdzone za pomocą testów hamujących tworzenie syncytium i adsorpcję wirusa. Ponadto po raz pierwszy wykazaliśmy synergistyczne działanie PLA2 HDP-2 z HIV NRTI, takimi jak lamiwudyna i tenofowir. Nasze dane wyraźnie wskazywały, że PLA2 wywierały wpływ poprzez bezpośrednie działanie na wirusa, a nie na komórki docelowe.

Materiały uzupełniające

Poniższe informacje pomocnicze można pobrać ze strony https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23031610/s1.

Wkład autora

Konceptualizacja, A.S. i Y.U.; metodologia, A.S.; dochodzenie, A.S., S.G. i A.O.; zasoby, V.S.; pisanie – przygotowanie oryginalnego szkicu, A.S.; pisanie – recenzja i redakcja, A.S., Y.U. i V.T.; nadzór, Y.U. i V.T.; administracja projektem, V.T.; i pozyskiwanie finansowania, Y.U. Wszyscy autorzy przeczytali i zgodzili się na opublikowaną wersję manuskryptu.

Finansowania

Badania te zostały sfinansowane przez Rosyjską Fundację Badań Podstawowych, numer grantu 20-04-60277.

Aktywność anty-HIV fosfolipazy jadu węża A2s: aktualizacje dla nowych enzymów i różnych szczepów wirusów. – Streszczenie – Europe PMC

Holler Box
Holler Box
%d bloggers like this: