Video Gallery
Syndrom sztokholmski
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Neale Donald Walsch „Wspólnota z Bogiem”-Część 1-Dziesięć Iluzji Ludzkości # 3. Iluzja Podziału
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Powiedz mi, jak mam cię kochać || Świat oczami duszy. Audycja o świadomości – 122
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Przyjdzie kryska na Matyska
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Niewidzialne książki #48: D. Parrish, Enlightenment Made Easy
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Życie To Pułapka .Wróżby Z Wróżką Astyllą
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
2/10 Siedem piekielnych potęg Czernoboha [1865]
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Spotkałem Prezydenta
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Skarby Riese – Dariusz Kwiecień – 2021
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Musisz to wiedzieć (1159) Czy Ci, których nie zbanowano, powiedzieli o tym?
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Zaawansowana Technologia Starożytnych. Al-Naslaa.
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Transakcje lipca – J. Kaczyński kupił Abramsy a J. Biden sprzedał Ukrainę [Geopolityczny Przewodnik]
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Ludzie, tu nikogo nie ma – Tokyo 2020
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Powstał LEK na W̲I̲R̲U̲S̲A̲! To koniec S̲Z̲C̲Z̲E̲P̲I̲E̲Ń̲ | WIADOMOŚCI
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Naszym celem nie było atakowanie Magdy Gessler. Spodziewałem się, że podejmie merytoryczną rozmowę.
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
24 07 2021 Agresywna Magda Gessler uszkodziła nam w Karpaczu telefon i mocno obciągała kabel.
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Musisz to wiedzieć (1157) 7-dniowa blokadę na kanale CW24
Posted on 27 lipca 2021 by Wenus
Secesja Texasu i Florydy. Pierwsze kroki. Biden i koncesja TVN. Słowacja tak jak Francja. 26.07.2021
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Wiem, że z tego wyjdę
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Czy motyw Władcy zwierząt, to symbol pradawnej globalnej religii?
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Dramat na lodzie. Nieznana historia (26.07.2021).-nagranie w j.rosyjskim
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Ludzkie koparki krypto WO2020060606, ⚡zawsze chodzi tylko o naszą energie⚡
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
„Dziadek mówił: Szymon, jeszcze niejedna burza przejdzie nad twoją głową” // Korzenie pamięci
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Kto zbudował Księżyc? – Po zdetonowaniu 11 ton TNT gong trwał ponad 3 godziny…
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Jak DUBAJ i EMIRATY zamienią się w DŻUNGLĘ? (SZTUCZNY DESZCZ)
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
20 Najzabawniejszych chwil z fanami w SPORCIE
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Moja Droga do Przebudzenia – Grażyna
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
CZAR PRL – AUTOSTOP
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Po czym poznać że ktoś zdradza
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Toksyczny związek i jak się od niego uwolnić
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Amerykanie G̲R̲O̲Ż̲Ą̲ Polsce! Drugiej szansy NIE BĘDZIE | WIADOMOŚCI
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Nie rajskie miejsce. Telewizja NII REN (26.07.2021).-nagranie w j.rosyjskim
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
KAIR – ZGUBIŁEM SIĘ I UPALIŁEM SZISZĄ Z DODATKIEM…
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Ukraińcy urzędnicy niemalże jak mafiosi. Przychodzą po haracz. Z wielkich firm chcą coś wycisnąć
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Człowiek planety Ziemia S02 odc.72
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
PRZEBUDZONY? To skończony ;) ~ Ważność 3 „I” & Natychmiastowe poradzenie sobie z ZAZDROŚCIĄ
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Dlaczego historię II wojny światowej trzeba napisać na nowo – część II
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Dlaczego historię II wojny światowej trzeba napisać na nowo – część I
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Szurcentrala wydaje OSTRZEŻENIE‼️Podrabiana chorągiewka operacja: niezakeczupowni🤫
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
ISKRA Z POLSKI – CZY TO MOŻLIWE? | RESHARMONICA
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Remonty Riese ciąg dalszy – Dariusz Kwiecień – lipiec – 2021
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Reset2024-informacje z Niemiec i okolicy
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
JASN0WIDZ PRACUJĄCA W TRANSIE – Barbara Zalewska © 2021 VTV
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Polityka I Żółty Pył. Pytania Globalne Z Wróżką Astyllą
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
NBP KUPUJE AKCJE? POD JAKIE WYDARZENIE INWESTUJE MARCIN TUSZKIEWICZ? // [INVESTORY]
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Na Żywo Z Egiptu – Habibi Plis Dont Break My Heart
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Cebula w Ameryce – Kościuszko w USA. Historia Bez Cenzury
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
MY JUŻ WSZYSTKO WIEMY – Roman Nacht © 2021 VTV
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
Doktor astrofizyki wyjaśnia podstawy. Zapnij pasy! (An interview by waykiwayki)-polskie napisy
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
1/10 Po 5 latach wracamy do pewnej Księgi
Posted on 26 lipca 2021 by Wenus
   POLITYKA STRONY M-FORUM !!! - WSZYSTKIE ZAMIESZCZANE MATERIAŁY ORAZ PREZENTOWANE I PROPAGOWANE - Poglądy i opinie zawarte w artykułach mogą być niezgodne ze stanowiskiem redakcji. !!!! REDAKCJA M-FORUM AV LIVE MA NA CELU PUBLIKOWANIE WSZYSTKICH INFORMACJI KTÓRE SĄ CENZUROWANE BEZ WZGLĘDU NA ZABARWIENIA POLITYCZNE , RELIGIJNE I OBYCZAJOWE - ZA KOMENTARZE I WYPOWIEDZI CZYTELNIKÓW I WIDZÓW NIE BIERZE ODPOWIEDZIALNOŚCI , Z WYJĄTKIEM TREŚCI O CHARAKTERZE PRZESTĘPCZYM KTÓRE BĘDĄ USUWANE BEZ OSTRZEŻEŃ     UWAGA !! WAŻNE - Poglądy i opinie zawarte w artykule mogą być niezgodne ze stanowiskiem redakcji. Zamieszczane artykułu są w wiekszości re- publikacjami materiałów z innych stron - REDAKCJA NIE INGERUJE W ICH TREŚCI W CELU ZACHOWANIA BEZSTRONNOŚCI , A CELEM PUBLIKACJI JEST PODDANIE TYCH MATERIAŁÓW POD OSĄD I KRYTYKĘ CZYTELNIKÓW W KTÓRE OPINIE NIE MOŻE INGEROWAĆ AUTOR MATERIAŁU W FORMIE MODERACJI LUB CENZURY

M-forum A.V Live.

TO PORTAL NA KTÓRYM CODZIENNIE ZNAJDZIESZ PONAD 100 INFORMACJI INFO NIUS W TYM MATERIAŁY CENZUROWANE LUB ZABRONIONE NA INNYCH PORTALACH POPRAWNYCH POOLITYCZNIE

CZERWONE

COVID-19 nie zaczął się w Chinach, zaczął się w Północnej Karolinie

10.00 avg. rating (96% score) - 1 vote

Zakazany: COVID rozpoczął się w Północnej Karolinie, nie Wuhan, dopiero 2 lata później

Autor: Gordon Duff, starszy redaktor

VT miała tę historię od samego początku. Teraz, gdy CIA oficjalnie powierzono zadanie znalezienia źródła COVID, kogoś, kogo można obwiniać, rozległy amerykański program obrony przed bronią biologiczną, który tworzy każdy paskudny wirus, jaki widzieliśmy, prawdopodobnie ebolę, z pewnością świńską grypę, a następnie „przypadkowo” je uwalnia w taki sposób, aby program CIA był obsługiwany.

Od czasu napisania tego artykułu zaczęliśmy przyglądać się światowym działaniom amerykańskiego wykonawcy nuklearnego/bio/chemicznego, ulubieńca Kushner-Trump, Battelle, oraz ich tajnych laboratoriów na całym świecie.

Kiedy zaczynaliśmy, grożono naszym ludziom. To był poważny błąd.

Prześlij ten dokument do dowolnego lekarza lub innego wykwalifikowanego specjalisty w dziedzinie nauk biologicznych. Zobacz, co mówią.

ABY UDOSTĘPNIĆ TEN ARTYKUŁ NA FACEBOOKU, SKOPIUJ i WKLEJ ten link:

https://www.veteranstodaynetwork.com/2020/04/29/documentary-proof-university-of-north-carolina-generated-covid-19/


Wprowadzenie

Poniższe dokumenty pokazują, że badania nad stworzeniem COVID 19 rozpoczęły się w Stanach Zjednoczonych w 2006 roku i zakończyły się udaną bronią biologiczną w 2015 roku, z pracami wykonanymi na Uniwersytecie Północnej Karoliny i na Harvardzie oraz w laboratorium Food and Drug Administration w Arkansas .

Ich praca nosiła tytuł:

Podobne do SARS skupisko krążących koronawirusów nietoperzy wykazuje potencjał do pojawienia się człowieka

Zrobili to i wiele więcej, o wiele więcej, o czym przeczytasz poniżej.

Jak mówił Trump, w kółko zaangażowani byli Chińczycy.

Kluczowe Laboratorium Patogenów Specjalnych i Bezpieczeństwa Biologicznego, Instytut Wirusologii Wuhan, Chińska Akademia Nauk, Wuhan, Chiny dostarczyło wirusa nietoperza z Wuhan, który został wykorzystany w amerykańskim badaniu. Ich nazwa została uwzględniona tylko z tego powodu.

COVID 19 był projektem broni biologicznej armii amerykańskiej, którego celem było wyprodukowanie choroby powodującej zapalenie płuc, której szczepienie u pacjentów powyżej 40. roku życia byłoby prawie niemożliwe.

Dowód jest tutaj, po prostu przewiń w dół. Badanie zostało przeprowadzone przez Uniwersytet Północnej Karoliny i sfinansowane przez USAID/CIA. Wybrał chińskiego wirusa nietoperza i zdecydował się na włączenie placówki medycznej również w Wuhan.

Teraz wiemy, dlaczego zasłona dymna winy za program, z którym Chiny miały niewiele lub nic wspólnego, coś szatańsko złego i czysto amerykańskiego.

W listopadzie 2015 r. opublikowano badanie określające zdolność do wytwarzania wirusa, z którym mamy teraz do czynienia. Wśród wielu zaangażowanych było laboratorium w Wuhan w Chinach. Od początku była wymieniana jako jedna z kilkudziesięciu, głównie amerykańskich, pracujących nad tym projektem.

Jednak jeden kluczowy uczestnik został pominięty, USAID. Podejrzewa się, bardzo głęboko, że USAID jest przykrywką dla amerykańskich badań nad bronią biologiczną, takich jak te prowadzone w Tbilisi, Gruzji i gdzie indziej, co jest mocno udokumentowane. To jest cytat, który dodaje USAID do grupy finansującej badania.

Zmieniać historię

20 listopada 2015

W wersji tego artykułu opublikowanej początkowo online autorzy pominęli źródło finansowania USAID-EPT-PREDICT od EcoHealth Alliance dla Z.-L.S. Błąd został poprawiony w wersji drukowanej, PDF i HTML tego artykułu.

[ Uwaga redaktora: Zaprezentujemy teraz stronniczy artykuł Pravdy, a poniżej rzeczywiste badanie dowodzące zdolności do wytwarzania COVID 19, udowadniając raz na zawsze, że nie jest to naturalnie występujący wirus.

Jeśli chodzi o to, kto co zrobił, to nie jest nasza praca, ale kategorycznie udowadniamy, że kiedy wspomina się o chińskim laboratorium, jest ono pomniejszym graczem w amerykańskim wysiłku, jak to wyczerpująco opisano poniżej.

To sprawia, że ​​dyskusja na temat laboratorium w Wuhan może być współwinna wojny biologicznej.

Podobnie, gdy magazyn Forbes i inni oświadczyli, że mogą udowodnić, że COVID 19 powstał w sposób naturalny i oczywiście mieli taki sam dostęp jak my, podejrzewamy, że są one częścią działań dezinformacyjnych związanych z USAID i wojną biologiczną.

Podejrzenie nie jest dowodem. Dowód jest dowodem i jest wystarczająco dużo dowodów, aby się w nim utopić. Nasze podziękowania dla amerykańskich lekarzy, którzy odpicowali się armii amerykańskiej i CIA i którzy pomogli nam doprowadzić nas tam, gdzie jesteśmy teraz, naród rozbity na kawałki… VeteransToday ]

Pravda.Ru: Taki materiał pojawił się w 2015 r. na stronie internetowej czasopisma naukowego Natura w 2015 r. Następnie autorzy twierdzili, że po pojawieniu się wirusa SARS (2002-2003) i zespołu oddechowego na Bliskim Wschodzie (MERS) naukowcy byli świadomi ryzyka międzygatunkowej transmisji, która doprowadziłaby do epidemii wśród ludzi.

Udany eksperyment laboratoryjny

Zespół badawczy badał między innymi nietoperze, które są największymi inkubatorami koronawirusów. Niemniej jednak nietoperze nie mogły przenosić koronawirusa na ludzi, ponieważ nie mogły wchodzić w interakcje z ludzkimi komórkami z receptorami ACE2.

W materiale stwierdzono również, że nietoperze podkowiec są nosicielami szczepu koronawirusa SARS, który może być przenoszony na ludzi. Został nazwany wirusem SHC014-CoV.

Aby lepiej zbadać tego wirusa, naukowcy skopiowali koronawirusa i zainfekowali go myszami laboratoryjnymi. Wyniki pokazały, że wirus jest naprawdę zdolny do wiązania się z ludzkimi komórkami za pomocą receptorów ACE2 i namnażania się w komórkach układu oddechowego.

W pracy badawczej zauważono, że materiały laboratoryjne, próbki i sprzęt, które zostały użyte w badaniach, zostały pozyskane z Wojskowego Instytutu Badań Medycznych Chorób Zakaźnych. Chociaż nie można jeszcze powiedzieć z całą pewnością, że wirus, który był testowany na myszach laboratoryjnych, jest tym samym, co koronawirus SARS-Cove-2.

Polityka NATO

Jednak ciekawe rzeczy można znaleźć we wcześniejszych dokumentach.

Na przykład:

Raport z działalności Sojuszu z 2019 roku mówi, że w 2019 roku pierwsze miejsce Sojuszu w badaniach i rozwoju zajmowała tematyka ochrony radiochemicznej i biologicznej (29%), przesuwając pozornie najbardziej palący problem Europy – antyterroryzm (okazało się, że 4 – m priorytet).
Rok wcześniej, w 2018 roku sytuacja była dokładnie odwrotna: terroryzm, tak jak powinien, był na pierwszym miejscu (28%), a ochrona radiochemiczna i biologiczna na czwartym (13%).

Jak pisze brukselski znicz w kanale telegramu, „biorąc pod uwagę brak widocznych przyczyn tak gwałtownej zmiany zainteresowań naukowych, istnieją dwie opcje i obie są nieprzyjemne:

albo NATO macha teraz piątym punktem, fałszując dane, aby pokazać „i zawsze przygotowaliśmy się na wirusy, jesteśmy nowocześni”,
lub nawet w 2019 roku w sojuszu, Boże wybacz mi, wiedzieli skąd się biorą kłopoty.

Tak, pierwsza opcja jest znacznie bardziej realna, ale fakty są zaskakujące.

Źródło:

Pravda


Oryginalne badania z 2015 r. Nieedytowane i kompletne

Opublikowano: 9 listopada 2015 r. Klaster krążących koronawirusów nietoperzy podobnych do SARS wykazuje możliwość pojawienia się człowieka. Vineet D Menachery, Boyd L Yount Jr, Kari Debbink, Sudhakar Agnihothram, Lisa E Gralinski, Jessica A Plante, Rachel L Graham, Trevor Scobey, Xing -Yi Ge, Eric F Donaldson, Scott H Randell, Antonio Lanzavecchia, Wayne A Marasco, Zhengli-Li Shi, Ralph S Baric

Nature Medicine tom 21, strony 1508-1513 (2015)

Sprostowanie do tego artykułu zostało opublikowane 6 kwietnia 2016 r.

Ten artykuł został zaktualizowany

Abstrakcyjny

Pojawienie się koronawirusa ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV) i bliskowschodniego zespołu oddechowego (MERS)-CoV podkreśla zagrożenie transmisją międzygatunkową prowadzącą do epidemii u ludzi. Tutaj badamy potencjał chorobowy wirusa podobnego do SARS, SHC014-CoV, który obecnie krąży w chińskich populacjach nietoperzy podkowca1. Korzystając z systemu odwrotnej genetyki SARS-CoV2, wytworzyliśmy i scharakteryzowaliśmy wirusa chimerycznego, w którym zachodzi ekspresja koronawirusa nietoperza SHC014 w dostosowanym do myszy szkielecie SARS-CoV.

Wyniki wskazują, że wirusy z grupy 2b kodujące wyskok SHC014 w szkielecie typu dzikiego mogą skutecznie wykorzystywać wiele ortologów enzymu konwertującego ludzką angiotensynę II (ACE2) receptora SARS, wydajnie replikować w pierwotnych ludzkich komórkach dróg oddechowych i osiągać miana równoważne in vitro epidemiczne szczepy SARS-CoV. Ponadto eksperymenty in vivo wykazują replikację wirusa chimerycznego w płucu myszy z godną uwagi patogenezą.

Ocena dostępnych metod immunoterapeutycznych i profilaktycznych opartych na SARS wykazała słabą skuteczność; zarówno przeciwciała monoklonalne, jak i szczepionka nie zneutralizowały i nie uchroniły przed zakażeniem CoV przy użyciu nowego białka wypustkowego.

Na podstawie tych ustaleń syntetycznie ponownie uzyskaliśmy zakaźnego rekombinowanego wirusa SHC014 pełnej długości i wykazaliśmy silną replikację wirusa zarówno in vitro, jak i in vivo. Nasza praca sugeruje potencjalne ryzyko ponownego pojawienia się SARS-CoV z wirusów krążących obecnie w populacjach nietoperzy.

Główny

Pojawienie się SARS-CoV zwiastowało nową erę w międzygatunkowym przenoszeniu ciężkich chorób układu oddechowego z globalizacją prowadzącą do szybkiego rozprzestrzeniania się na całym świecie i ogromnych skutków ekonomicznych3,4. Od tego czasu kilka szczepów — w tym szczepy wirusa grypy A H5N1, H1N1 i H7N9 oraz MERS-CoV — wyłoniło się z populacji zwierząt, powodując znaczne choroby, śmiertelność i trudności ekonomiczne w dotkniętych chorobą regionach5. Chociaż środki zdrowia publicznego były w stanie powstrzymać epidemię SARS-CoV4, ostatnie badania metagenomiczne zidentyfikowały sekwencje blisko spokrewnionych wirusów podobnych do SARS krążących w chińskich populacjach nietoperzy, które mogą stanowić przyszłe zagrożenie1,6.

Jednak same dane sekwencyjne zapewniają minimalny wgląd w identyfikację i przygotowanie na przyszłe wirusy przed pandemią. Dlatego, aby zbadać potencjał wylęgu (tj. możliwość zakażenia ludzi) krążących CoV nietoperzy, zbudowaliśmy wirusa chimerycznego kodującego nowe, odzwierzęce białko wypustek CoV — z sekwencji RsSHC014-CoV, która została wyizolowana z chińskich nietoperzy podkowca1— w kontekście szkieletu dostosowanego do myszy SARS-CoV. Wirus hybrydowy pozwolił nam ocenić zdolność nowego białka wypustkowego do wywoływania choroby niezależnie od innych niezbędnych mutacji adaptacyjnych w jego naturalnym szkielecie.

Stosując to podejście, scharakteryzowaliśmy zakażenie CoV za pośrednictwem białka wypustkowego SHC014 w pierwotnych ludzkich komórkach dróg oddechowych i in vivo oraz przetestowaliśmy skuteczność dostępnych immunologicznych środków terapeutycznych przeciwko SHC014-CoV. Razem strategia przekłada dane metagenomiczne, aby pomóc przewidywać i przygotować się na przyszłe pojawiające się wirusy.

Sekwencje SHC014 i pokrewny RsWIV1-CoV pokazują, że te CoV są najbliżej spokrewnionymi z epidemicznymi szczepami SARS-CoV (Fig. 1a, b); istnieją jednak ważne różnice w 14 resztach, które wiążą ludzki ACE2, receptor SARS-CoV, w tym pięć, które są krytyczne dla zakresu gospodarza: Y442, L472, N479, T487 i Y491 (ref. 7).

W WIV1 trzy z tych reszt różnią się od epidemicznego szczepu SARS-CoV Urbani, ale nie oczekiwano, że zmienią wiązanie z ACE2 (ryc. uzupełniająca 1a, b i tabela uzupełniająca 1). Fakt ten potwierdzają zarówno eksperymenty pseudotypowania, w których zmierzono zdolność lentiwirusów kodujących białka kolców WIV1 do wnikania do komórek wyrażających ludzki ACE2 (ryc. uzupełniający 1), jak i testy replikacji WIV1-CoV in vitro (odnośnik 1). W przeciwieństwie do tego 7 z 14 reszt interakcji ACE2 w SHC014 różni się od tych w SARS-CoV, w tym wszystkie pięć reszt krytycznych dla zakresu gospodarza (ryc. uzupełniająca 1c i tabela uzupełniająca 1).

Te zmiany, w połączeniu z niepowodzeniem pseudotypowanych lentiwirusów z ekspresją wypustki SHC014 do wejścia do komórek (rysunek uzupełniający 1d), sugerowały, że wypust SHC014 nie jest zdolny do wiązania ludzkiego ACE2. Zgłoszono jednak podobne zmiany w pokrewnych szczepach SARS-CoV, aby umożliwić wiązanie ACE27,8, co sugeruje, że do weryfikacji wymagane były dodatkowe testy funkcjonalne.

Dlatego zsyntetyzowaliśmy skok SHC014 w kontekście zdolnego do replikacji, przystosowanego do myszy szkieletu SARS-CoV (dalej określamy chimeryczny CoV jako SHC014-MA15), aby zmaksymalizować możliwość patogenezy i badań szczepionek u myszy (rysunek uzupełniający 2a). Pomimo przewidywań zarówno z modelowania opartego na strukturze, jak i eksperymentów z pseudotypowaniem, SHC014-MA15 był żywotny i replikowany do wysokich mian w komórkach Vero (ryc. uzupełniająca 2b). Podobnie jak SARS, SHC014-MA15 również wymagał funkcjonalnej cząsteczki ACE2 do wejścia i może wykorzystywać ortologów ACE2 człowieka, cyweta i nietoperza (ryc. uzupełniający 2c, d).

Aby przetestować zdolność kolca SHC014 do pośredniczenia w infekcji ludzkich dróg oddechowych, zbadaliśmy wrażliwość ludzkiej linii komórek nabłonkowych dróg oddechowych Calu-3 2B4 (ref. 9) na infekcję i znaleźliśmy silną replikację SHC014-MA15, porównywalną z tą z SARS-CoV Urbani (ryc. 1c).

Aby rozszerzyć te odkrycia, pierwotne ludzkie hodowle nabłonka dróg oddechowych (HAE) zostały zainfekowane i wykazały silną replikację obu wirusów (ryc. 1d). Łącznie dane potwierdzają zdolność wirusów z kolcem SHC014 do infekowania ludzkich komórek dróg oddechowych i podkreślają potencjalne zagrożenie transmisją międzygatunkową SHC014-CoV.

Rycina 1: Wirusy podobne do SARS replikują się w ludzkich komórkach dróg oddechowych i wytwarzają patogenezę in vivo.

(a) Sekwencje genomu pełnej długości reprezentatywnych CoV zostały dopasowane i zmapowane filogenetycznie zgodnie z opisem w metodach online. Skala przedstawia podstawienia nukleotydów, przy czym znakowana jest tylko obsługa ładowania początkowego powyżej 70%. Drzewo przedstawia CoV podzielone na trzy odrębne grupy filogenetyczne, zdefiniowane jako α-CoV, β-CoV i γ-CoV. Klasyczne klastry podgrup są oznaczone jako 2a, 2b, 2c i 2d dla β-CoV oraz jako 1a i 1b dla α-CoV. (b) Sekwencje aminokwasowe domen S1 wypustek reprezentatywnych β-CoV z grupy 2b, w tym SARS-CoV, dopasowano i zmapowano filogenetycznie. Skala przedstawia podstawienia aminokwasów. (c,d) Replikacja wirusowa SARS-CoV Urbani (czarny) i SHC014-MA15 (zielony) po zakażeniu komórek Calu-3 2B4 (c) lub dobrze zróżnicowanych, pierwotnych hodowli komórkowych HAE na granicy powietrze-ciecz (d) w wielokrotność infekcji (MOI) 0,01 dla obu typów komórek. Próbki pobrano w poszczególnych punktach czasowych z powtórzeniami biologicznymi (n =3) zarówno dla eksperymentów Calu-3, jak i HAE. (e,f) Utrata masy ciała (n = 9 dla SARS-CoV MA15; n = 16 dla SHC014-MA15) (e) i replikacja wirusa w płucach (n = 3 dla SARS-CoV MA15; n = 4 dla SHC014- MA15) (f) 10-tygodniowych myszy BALB/c zakażonych 1 × 104 pfu przystosowanego do myszy SARS-CoV MA15 (czarny) lub SHC014-MA15 (zielony) drogą donosową (i.n.). (g, h) Przedstawiono reprezentatywne obrazy skrawków płuc barwionych pod kątem antygenu SARS-CoV N z myszy zakażonych SARS-CoV MA15 (n = 3 myszy) (g) lub SHC014-MA15 (n = 4 myszy) (h). Dla każdego wykresu wartość środkowa reprezentuje średnią grupy, a słupki błędów definiują s.e.m. Skala, 1 mm.

Full size image

To evaluate the role of the SHC014 spike in mediating infection in vivo, we infected 10-week-old BALB/c mice with 104 plaque-forming units (p.f.u.) of either SARS-MA15 or SHC014-MA15 (Fig. 1e–h). Animals infected with SARS-MA15 experienced rapid weight loss and lethality by 4 d post-infection (d.p.i.); in contrast, SHC014-MA15 infection produced substantial weight loss (10%) but no lethality in mice (Fig. 1e). Examination of viral replication revealed nearly equivalent viral titers from the lungs of mice infected with SARS-MA15 or SHC014-MA15 (Fig. 1f). Whereas lungs from the SARS-MA15–infected mice showed robust staining in both the terminal bronchioles and the lung parenchyma 2 d.p.i. (Fig. 1g), those of SHC014-MA15–infected mice showed reduced airway antigen staining (Fig. 1h); in contrast, no deficit in antigen staining was observed in the parenchyma or in the overall histology scoring, suggesting differential infection of lung tissue for SHC014-MA15 (Supplementary Table 2).

We next analyzed infection in more susceptible, aged (12-month-old) animals. SARS-MA15–infected animals rapidly lost weight and succumbed to infection (Supplementary Fig. 3a,b). SHC014-MA15 infection-induced robust and sustained weight loss, but had minimal lethality. Trends in the histology and antigen staining patterns that we observed in young mice were conserved in the older animals (Supplementary Table 3). We excluded the possibility that SHC014-MA15 was mediating infection through an alternative receptor on the basis of experiments using Ace2−/− mice, which did not show weight loss or antigen staining after SHC014-MA15 infection (Supplementary Fig. 4a,b and Supplementary Table 2). Together, the data indicate that viruses with the SHC014 spike are capable of inducing weight loss in mice in the context of a virulent CoV backbone.

Given the preclinical efficacy of Ebola monoclonal antibody therapies, such as ZMApp10, we next sought to determine the efficacy of SARS-CoV monoclonal antibodies against infection with SHC014-MA15. Four broadly neutralizing human monoclonal antibodies targeting SARS-CoV spike protein had been previously reported and are probable reagents for immunotherapy11,12,13. We examined the effect of these antibodies on viral replication (expressed as percentage inhibition of viral replication) and found that whereas wild-type SARS-CoV Urbani was strongly neutralized by all four antibodies at relatively low antibody concentrations (Fig. 2a–d), neutralization varied for SHC014-MA15. Fm6, an antibody generated by phage display and escape mutants11,12, achieved only background levels of inhibition of SHC014-MA15 replication (Fig. 2a). Similarly, antibodies 230.15 and 227.14, which were derived from memory B cells of SARS-CoV–infected patients13, also failed to block SHC014-MA15 replication (Fig. 2b,c). For all three antibodies, differences between the SARS and SHC014 spike amino acid sequences corresponded to direct or adjacent residue changes found in SARS-CoV escape mutants (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q/E), which probably explains the absence of the antibodies’ neutralizing activity against SHC014. Finally, monoclonal antibody 109.8 was able to achieve 50% neutralization of SHC014-MA15, but only at high concentrations (10 μg/ml) (Fig. 2d). Together, the results demonstrate that broadly neutralizing antibodies against SARS-CoV may only have marginal efficacy against emergent SARS-like CoV strains such as SHC014.

Figure 2: SARS-CoV monoclonal antibodies have marginal efficacy against SARS-like CoVs.

figure2(ad) Neutralization assays evaluating efficacy (measured as a reduction in the number of plaques) of a panel of monoclonal antibodies, which were all originally generated against epidemic SARS-CoV, against infection of Vero cells with SARS-CoV Urbani (black) or SHC014-MA15 (green). The antibodies tested were fm6 (n = 3 for Urbani; n = 5 for SHC014-MA15)11,12 (a), 230.15 (n = 3 for Urbani; n = 2 for SHC014-MA15) (b), 227.15 (n = 3 for Urbani; n = 5 for SHC014-MA15) (c) and 109.8 (n = 3 for Urbani; n = 2 for SHC014-MA15)13 (d). Each data point represents the group mean and error bars define the s.e.m. Note that the error bars in SARS-CoV Urbani–infected Vero cells in b,c are overlapped by the symbols and are not visible. 

Obraz w pełnym rozmiarze

Aby ocenić skuteczność istniejących szczepionek przeciwko infekcji SHC014-MA15, zaszczepiliśmy starsze myszy podwójnie inaktywowanym całym SARS-CoV (DIV). Wcześniejsze prace wykazały, że DIV może neutralizować i chronić młode myszy przed prowokacją homologicznym wirusem14; jednak szczepionka nie chroniła starych zwierząt, u których zaobserwowano również nasiloną patologię immunologiczną, co wskazuje na możliwość uszkodzenia zwierząt z powodu szczepienia15. Tutaj stwierdziliśmy, że DIV nie zapewnia ochrony przed prowokacją SHC014-MA15 w odniesieniu do utraty wagi lub miana wirusa (rysunek uzupełniający 5a,b). Zgodnie z poprzednim doniesieniem z innymi grupami heterologicznymi 2b CoVs15, surowica od starszych myszy zaszczepionych DIV również nie zneutralizowała SHC014-MA15 (rysunek uzupełniający 5c).

Warto zauważyć, że szczepienie DIV spowodowało silną patologię immunologiczną (tabela uzupełniająca 4) i eozynofilię (ryc. uzupełniająca 5d–f). Łącznie wyniki te potwierdzają, że szczepionka DIV nie chroniłaby przed zakażeniem SHC014 i mogłaby prawdopodobnie nasilać chorobę w zaszczepionej grupie w podeszłym wieku.

W przeciwieństwie do szczepienia myszy DIV, zastosowanie SHC014-MA15 jako żywej, atenuowanej szczepionki wykazało potencjalną ochronę krzyżową przed prowokacją SARS-CoV, ale wyniki mają ważne zastrzeżenia. Zainfekowaliśmy młode myszy 104 p.fu. SHC014-MA15 i obserwował je przez 28 dni. Następnie prowokowaliśmy myszy SARS-MA15 w dniu 29 (ryc. uzupełniająca 6a). Wcześniejsze zakażenie myszy wysoką dawką SHC014-MA15 nadało ochronę przed prowokacją śmiertelną dawką SARS-MA15, chociaż wystąpiła tylko minimalna odpowiedź neutralizacji SARS-CoV z antysurowic wywołanych 28 dni po zakażeniu SHC014-MA15 ( Rys. uzupełniający 6b, 1:200). W przypadku braku dodatkowej dawki antygenu, 28 d.p.i. reprezentuje oczekiwany szczyt mian przeciwciał i sugeruje, że z czasem będzie zmniejszona ochrona przed SARS-CoV16,17. Podobne wyniki pokazujące ochronę przed prowokacją śmiertelną dawką SARS-CoV zaobserwowano u starszych myszy BALB/c w odniesieniu do utraty wagi i replikacji wirusa (ryc. uzupełniająca 6c, d). Jednak dawka zakażenia SHC014-MA15 wynosząca 104 p.f.u. wywołał >10% utratę masy ciała i śmiertelność u niektórych starszych zwierząt (ryc. 1 i uzupełniający ryc. 3). Stwierdziliśmy, że szczepienie niższą dawką SHC014-MA15 (100 p.f.u.) nie indukowało utraty wagi, ale również nie chroniło starszych zwierząt przed prowokacją śmiertelną dawką SARS-MA15 (ryc. uzupełniająca 6e, f). Łącznie dane sugerują, że prowokacja SHC014-MA15 może nadawać krzyżową ochronę przed SARS-CoV poprzez konserwowane epitopy, ale wymagana dawka indukuje patogenezę i wyklucza zastosowanie jako atenuowanej szczepionki.

Ustaliwszy, że kolec SHC014 ma zdolność pośredniczenia w infekcji ludzkich komórek i wywoływania choroby u myszy, następnie zsyntetyzowaliśmy zakaźny klon SHC014-CoV pełnej długości w oparciu o podejście stosowane dla SARS-CoV (ryc. 3a)2. Replikacja w komórkach Vero nie wykazała deficytu SHC014-CoV w porównaniu z SARS-CoV (ryc. 3b); jednak SHC014-CoV był znacząco (P < 0,01) atenuowany w pierwotnych hodowlach HAE zarówno w 24, jak i 48 h po zakażeniu (ryc. 3c). Infekcja in vivo myszy nie wykazała znaczącej utraty masy ciała, ale wykazała zmniejszoną replikację wirusa w płucach pełnej długości infekcji SHC014-CoV w porównaniu z SARS-CoV Urbani (ryc. 3d, e). Łącznie wyniki ustalają żywotność pełnej długości SHC014-CoV, ale sugerują, że wymagana jest dalsza adaptacja, aby jego replikacja była równoważna z replikacją epidemii SARS-CoV w ludzkich komórkach oddechowych iu myszy.

Rycina 3: Pełnej długości SHC014-CoV replikuje się w ludzkich drogach oddechowych, ale nie wykazuje zjadliwości epidemii SARS-CoV.

(a) Schemat klonu molekularnego SHC014-CoV, który został zsyntetyzowany jako sześć przylegających do siebie cDNA (oznaczonych jako SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E i SHC014F) otoczonych przez unikalne miejsca BglI, które umożliwiły bezpośrednie składanie pełnej ekspresji cDNA otwarte ramki odczytu (dla 1a, 1b, spike, 3, koperta, matryca, 6-8 i nukleokapsyd). Podkreślone nukleotydy reprezentują sekwencje wystające utworzone po cięciu enzymem restrykcyjnym. (b,c) Replikacja wirusa SARS-CoV Urbani (czarny) lub SHC014-CoV (zielony) po zakażeniu komórek Vero (b) lub dobrze zróżnicowanych, pierwotnych hodowli komórkowych HAE na granicy powietrze-ciecz (c) przy MOI wynoszącym 0,01. Próbki pobrano w poszczególnych punktach czasowych z powtórzeniami biologicznymi (n = 3) dla każdej grupy. Dane reprezentują jeden eksperyment dla komórek Vero i HAE. (d, e) Utrata masy ciała (n = 3 dla SARS-CoV MA15, n = 7 dla SHC014-CoV; n = 6 dla SARS-Urbani) (d) i replikacja wirusa w płucach (n = 3 dla SARS-Urbani i SHC014-CoV) (e) 10-tygodniowych myszy BALB/c zakażonych 1 × 105 pfu SARS-CoV MA15 (szary), SHC014-CoV (zielony) lub SARS-CoV Urbani (czarny) poprzez i.n. trasa. Każdy punkt danych reprezentuje średnią grupy, a słupki błędów definiują s.e.m. **P <0,01 i ***P <0,001 przy użyciu dwustronnego testu t-Studenta dla poszczególnych punktów czasowych.

 

Podczas epidemii SARS-CoV szybko ustalono powiązania między cywetami palmowymi a szczepami CoV wykrytymi u ludzi4.

Opierając się na tym odkryciu, powszechny paradygmat wyłaniania się twierdzi, że epidemia SARS-CoV powstała jako wirus nietoperza, przeskoczył do civet i wprowadził zmiany w domenie wiążącej receptor (RBD), aby poprawić wiązanie z civet Ace2 (ref. 18).

Późniejsza ekspozycja na ludzi na rynkach żywych zwierząt pozwoliła na zarażenie człowieka szczepem civet, który z kolei zaadaptował się, by stać się szczepem epidemicznym (ryc. 4a).

Jednak analiza filogenetyczna sugeruje, że wczesne ludzkie szczepy SARS wydają się bardziej spokrewnione ze szczepami nietoperzy niż ze szczepami civet18.

Dlatego drugi paradygmat twierdzi, że bezpośrednia transmisja nietoperz-człowiek zainicjowała pojawienie się SARS-CoV i że cywety palmowe służyły jako wtórny żywiciel i rezerwuar dla ciągłej infekcji (ryc. 4b)19. W przypadku obu paradygmatów adaptacja kolców u drugiego gospodarza jest postrzegana jako konieczność, przy czym oczekuje się, że większość mutacji wystąpi w obrębie RBD, ułatwiając w ten sposób poprawę infekcji. Obie teorie sugerują, że pule CoV nietoperzy są ograniczone, a mutacje w zakresie gospodarzy są zarówno losowe, jak i rzadkie, co zmniejsza prawdopodobieństwo przyszłych zdarzeń pojawienia się u ludzi.

Rysunek 4: Paradygmaty pojawiania się koronawirusów.

Szczepy koronawirusa są utrzymywane w pulach quasi-gatunkowych krążących w populacjach nietoperzy. (a,b) Tradycyjne teorie pojawienia się SARS-CoV zakładają, że mutanty z zakresu gospodarzy (czerwone kółko) reprezentują losowe i rzadkie przypadki, które umożliwiają infekcję alternatywnych żywicieli. Paradygmat żywiciela wtórnego (a) twierdzi, że żywiciel inny niż człowiek jest zarażony wirusem prekursora nietoperza i poprzez adaptację ułatwia przenoszenie na ludzi; późniejsza replikacja u ludzi prowadzi do epidemicznego szczepu wirusa. Paradygmat bezpośredni (b) sugeruje, że transmisja zachodzi między nietoperzami a ludźmi bez wymogu żywiciela pośredniego; selekcja następuje następnie w populacji ludzkiej z blisko spokrewnionymi wirusami replikującymi się w gospodarzu wtórnym, co pozwala na ciągłe utrzymywanie się wirusa i adaptację w obu. (c) Dane z chimerycznych wirusów SARS-podobnych dowodzą, że pule quasi-gatunkowe zawierają wiele wirusów zdolnych do infekowania ludzkich komórek bez potrzeby mutacji (czerwone kółka). Chociaż do pojawienia się epidemii mogą być wymagane adaptacje u gospodarzy wtórnych lub ludzkich, jeśli wirusy zawierające wypustki SHC014 zrekombinują z wirulentnymi szkieletami CoV (kółka z zielonymi konturami), u ludzi może wystąpić choroba epidemiczna. Istniejące elementy wsparcia danych wszystkich trzech paradygmatów.

 

Obraz w pełnym rozmiarze

Chociaż nasze badanie nie unieważnia innych dróg wylęgu, przemawia za trzecim paradygmatem, w którym krążące pule CoV nietoperzy utrzymują „zrównoważone” białka kolców, które są zdolne do infekowania ludzi bez mutacji lub adaptacji (ryc. 4c). Hipotezę tę ilustruje zdolność wirusa chimerycznego zawierającego wyskok SHC014 w szkielecie SARS-CoV do wywoływania silnej infekcji zarówno w hodowlach ludzkich dróg oddechowych, jak i u myszy bez adaptacji RBD.

W połączeniu z obserwacjami wcześniej zidentyfikowanych patogennych szkieletów CoV3,20, nasze wyniki sugerują, że materiały wyjściowe wymagane dla powstających szczepów podobnych do SARS krążą obecnie w rezerwuarach zwierzęcych. Warto zauważyć, że chociaż pełnej długości SHC014-CoV prawdopodobnie wymaga dodatkowej adaptacji szkieletu, aby pośredniczyć w chorobie człowieka, udokumentowane zdarzenia rekombinacji o wysokiej częstotliwości w rodzinach CoV podkreślają możliwość pojawienia się w przyszłości i potrzebę dalszych przygotowań.

Do tej pory badania przesiewowe genomiki populacji zwierząt były wykorzystywane przede wszystkim do identyfikacji nowych wirusów w warunkach epidemii21. Podejście tutaj rozszerza te zbiory danych, aby zbadać kwestie pojawienia się wirusa i skuteczności terapeutycznej. Uważamy, że wirusy ze skokiem SHC014 są potencjalnym zagrożeniem ze względu na ich zdolność do replikacji w pierwotnych kulturach ludzkich dróg oddechowych, najlepszym dostępnym modelu choroby u ludzi. Ponadto obserwowana patogeneza u myszy wskazuje na zdolność wirusów zawierających SHC014 do wywoływania choroby w modelach ssaków, bez adaptacji RBD.

Warto zauważyć, że różnicujący tropizm w płucach w porównaniu z SARS-MA15 i atenuacja pełnej długości SHC014-CoV w hodowlach HAE w stosunku do SARS-CoV Urbani sugerują, że czynniki wykraczające poza wiązanie ACE2 – w tym procesywność kolców, biodostępność receptora lub antagonizm odpowiedzi immunologicznych gospodarza – może przyczynić się do pojawienia się. Jednak wymagane są dalsze badania na naczelnych innych niż człowiek, aby przełożyć te odkrycia na potencjał patogenny u ludzi.

Co ważne, niepowodzenie dostępnych środków terapeutycznych definiuje krytyczną potrzebę dalszych badań i opracowania terapii. Dzięki tej wiedzy można opracować programy nadzoru, odczynniki diagnostyczne i skuteczne terapie, które chronią przed pojawieniem się CoV swoistych dla grupy 2b, takich jak SHC014, i można je zastosować do innych gałęzi CoV, które utrzymują podobnie heterogeniczne pule.

Oprócz oferowania przygotowania przeciwko przyszłym pojawiającym się wirusom, podejście to należy rozważyć w kontekście zleconej przez rząd USA przerwy w badaniach nad uzyskaniem funkcji (GOF)22.

Na podstawie wcześniejszych modeli pojawiania się (ryc. 4a, b) nie oczekiwano, że tworzenie wirusów chimerycznych, takich jak SHC014-MA15, zwiększy patogenność. Chociaż SHC014-MA15 jest atenuowany w stosunku do swojego rodzicielskiego SARS-CoV przystosowanego do myszy, podobne badania oceniające patogenność CoV z dzikim szpicem Urbani w obrębie szkieletu MA15 wykazały brak utraty wagi u myszy i zmniejszoną replikację wirusa23. Tak więc, w odniesieniu do kolca Urbaniego – MA15 CoV, SHC014-MA15 ponownie wykazuje patogenezę (ryc. 1).

Na podstawie tych odkryć naukowe panele przeglądowe mogą uznać, że podobne badania nad tworzeniem wirusów chimerycznych w oparciu o krążące szczepy są zbyt ryzykowne, ponieważ nie można wykluczyć zwiększonej patogenności w modelach ssaków.

W połączeniu z ograniczeniami dotyczącymi szczepów przystosowanych do myszy i rozwojem przeciwciał monoklonalnych przy użyciu mutantów wymykających się, badania nad powstawaniem CoV i skutecznością terapeutyczną mogą być znacznie ograniczone. Łącznie te dane i ograniczenia stanowią skrzyżowanie problemów badawczych GOF; potencjał przygotowania się i łagodzenia przyszłych epidemii należy rozważyć z ryzykiem tworzenia bardziej niebezpiecznych patogenów. Przy opracowywaniu polityk, które posuwają się naprzód, ważne jest, aby wziąć pod uwagę wartość danych wygenerowanych przez te badania i czy tego rodzaju badania nad wirusami chimerycznymi uzasadniają dalsze badania w porównaniu z nieodłącznymi zagrożeniami.

Ogólnie rzecz biorąc, nasze podejście wykorzystało dane metagenomiczne do zidentyfikowania potencjalnego zagrożenia stwarzanego przez krążącego nietoperza podobnego do SARS CoV SHC014. Ze względu na zdolność chimerycznych wirusów SHC014 do replikacji w hodowlach ludzkich dróg oddechowych, wywoływania patogenezy in vivo i unikania obecnych leków, istnieje potrzeba zarówno nadzoru, jak i ulepszonej terapii przeciwko krążącym wirusom podobnym do SARS. Nasze podejście umożliwia również wykorzystanie danych metagenomicznych do przewidywania pojawienia się wirusa i zastosowania tej wiedzy w przygotowaniach do leczenia przyszłych pojawiających się infekcji wirusowych.

Metody
Wirusy, komórki, infekcje in vitro i testy łysinkowe

SARS-CoV typu dzikiego (Urbani), SARS-CoV przystosowany do myszy (MA15) i chimeryczne SARS-podobne CoV hodowano na komórkach Vero E6 (uzyskanych z Instytutu Chorób Zakaźnych Armii Stanów Zjednoczonych), hodowanych w zmodyfikowanym przez Dulbecco Eagle’s pożywkę (DMEM) (Gibco, CA) i 5% płodową surowicę klonów (FCS) (Hyclone, South Logan, UT) wraz z antybiotykiem/środkiem przeciwgrzybicznym (Gibco, Carlsbad, CA). Komórki DBT (laboratorium Baric, źródło nieznane) wyrażające ortologi ACE2 zostały wcześniej opisane zarówno dla człowieka, jak i cyweta; Sekwencja nietoperza Ace2 została oparta na sekwencji z Rhinolophus leschenaulti, a komórki DBT wyrażające nietoperza Ace2 zostały ustalone zgodnie z wcześniejszym opisem8.

Eksperymenty z pseudotypowaniem były podobne do tych z użyciem pseudowirusa opartego na HIV, przygotowanego zgodnie z wcześniejszym opisem10 i zbadanego na komórkach HeLa (Wuhan Institute of Virology), które wyrażały ortologi ACE2. Komórki HeLa hodowano w minimalnej podstawowej pożywce (MEM) (Gibco, CA) uzupełnionej 10% FCS (Gibco, CA), jak opisano wcześniej24.

Krzywe wzrostu w Vero E6, DBT, Calu-3 2B4 i pierwotnych ludzkich komórkach nabłonka dróg oddechowych wykonano jak opisano wcześniej8,25. Żaden z zapasów roboczych linii komórkowych nie został ostatnio uwierzytelniony ani przetestowany pod kątem mykoplazmy, chociaż oryginalne zapasy nasion użyte do stworzenia roboczych zapasów są wolne od zanieczyszczeń. Płuca ludzkie do hodowli HAE pobrano zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Uniwersytet Karoliny Północnej w Chapel Hill Institutional Review Board. Hodowle HAE reprezentują wysoce zróżnicowany nabłonek dróg oddechowych człowieka, zawierający komórki nabłonka rzęskowego i nierzęskowego, a także komórki kubkowe. Kultury hoduje się również na granicy powietrze-ciecz przez kilka tygodni przed użyciem, jak opisano wcześniej26.

W skrócie, komórki przepłukano PBS i zaszczepiono wirusem lub próbnym rozcieńczeniem w PBS przez 40 min w 37°C. Po zaszczepieniu komórki przemyto trzy razy i dodano świeżą pożywkę, aby oznaczyć czas „0”. W każdym opisanym punkcie czasowym zebrano trzy lub więcej powtórzeń biologicznych. W żadnej kolekcji próbek nie stosowano zaślepiania ani prób losowych. Całą hodowlę wirusa przeprowadzono w laboratorium na poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 3 z nadmiarowymi wentylatorami w szafach bezpieczeństwa biologicznego, jak opisano wcześniej przez naszą grupę2. Wszyscy pracownicy nosili elektryczne maski oczyszczające powietrze (Breathe Easy, 3M) z kombinezonami Tyvek, fartuchami i bucikami oraz mieli podwójne rękawiczki.

Grupowanie sekwencji i modelowanie strukturalne.

Pełnej długości sekwencje genomowe i sekwencje aminokwasowe domen S1 skoku reprezentatywnych CoV zostały pobrane z Genbank lub Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC), wyrównane z ClustalX i porównane filogenetycznie przy użyciu oszacowania maksymalnego prawdopodobieństwa przy użyciu 100 bootstrapów lub przez za pomocą odpowiednio pakietu PhyML. Drzewo zostało wygenerowane z wykorzystaniem maksymalnego prawdopodobieństwa za pomocą pakietu PhyML. Skala przedstawia podstawienia nukleotydów. Tylko węzły z obsługą ładowania początkowego powyżej 70% są oznaczone.

Drzewo pokazuje, że CoV są podzielone na trzy odrębne grupy filogenetyczne zdefiniowane jako α-CoV, β-CoV i γ-CoV. Klasyczne klastry podgrup są oznaczone jako 2a, 2b, 2c i 2d dla β-CoV oraz 1a i 1b dla α-CoV. Modele strukturalne zostały wygenerowane przy użyciu Modellera (Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit) w celu wygenerowania modeli homologii dla SHC014 i Rs3367 SARS RBD w kompleksie z ACE2 w oparciu o strukturę krystaliczną 2AJF (Bank danych białkowych). Modele homologiczne wizualizowano i manipulowano w MacPyMol (wersja 1.3).

Budowa wirusów chimerycznych typu SARS.

Zarówno wirusy typu dzikiego, jak i chimeryczne pochodziły z SARS-CoV Urbani lub odpowiedniego zakaźnego klonu przystosowanego do myszy (SARS-CoV MA15) (ic), jak opisano wcześniej27.

Plazmidy zawierające sekwencje wypustek dla SHC014 wyekstrahowano przez trawienie restrykcyjne i zligowano z plazmidami E i F zakaźnego klonu MA15. Klon zaprojektowano i zakupiono z Bio Basic jako sześć przylegających do siebie cDNA przy użyciu opublikowanych sekwencji oflankowanych unikalnymi miejscami dla endonukleaz restrykcyjnych klasy II (Bgll). Następnie plazmidy zawierające fragmenty genomu chimerowego SARS-CoV i SHC014-CoV typu dzikiego amplifikowano, wycinano, ligowano i oczyszczano.

Następnie przeprowadzono reakcje transkrypcyjne in vitro w celu zsyntetyzowania genomowego RNA o pełnej długości, które transfekowano do komórek Vero E6, jak opisano wcześniej2. Pożywkę z transfekowanych komórek zbierano i służyła jako zapasy do zaszczepiania do kolejnych eksperymentów. Wirusy chimeryczne i pełnej długości potwierdzono analizą sekwencji przed zastosowaniem w tych badaniach. Syntetyczna konstrukcja chimerycznego mutanta i pełnej długości SHC014-CoV została zatwierdzona przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Północnej Karoliny oraz Komitet ds. Badań nad Podwójnym Zastosowaniem.

Oświadczenie etyczne

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt przez Urząd Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych (OLAW), PZH. Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Północnej Karoliny w Chapel Hill (UNC, numer zezwolenia A-3410-01) zatwierdził protokół badań na zwierzętach (IACUC #13-033) zastosowany w tych badaniach.
Więcej o tekście źródłowymWskaż tekst źródłowy, by wyświetlić dodatkowe informacje o tłumaczeniu

Myszy a infekcja in vivo

Samice, 10-tygodniowe i 12-miesięczne myszy BALB/cAnNHsD zamówiono z Harlan Laboratories. Infekcje myszy przeprowadzono jak opisano wcześniej20. W skrócie, zwierzęta przeniesiono do laboratorium BSL3 i pozwolono im zaaklimatyzować się na 1 tydzień przed infekcją. W przypadku infekcji i szczepienia żywym atenuowanym wirusem, myszy znieczulano mieszaniną ketaminy i ksylazyny i infekowano donosowo po prowokacji 50 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub rozcieńczonym wirusem z trzema lub czterema myszami na punkt czasowy, na grupy infekcji na dawkę, jak opisano w legendach rycin.

W przypadku poszczególnych myszy zapisy wskazujące na infekcję, w tym brak inhalacji całej dawki, bąbelkowanie inokulum z nosa lub infekcja przez usta, mogły prowadzić do wykluczenia danych dotyczących myszy według uznania badacza; po zakażeniu nie zdefiniowano żadnych innych wcześniej ustalonych kryteriów wykluczenia lub włączenia. W żadnych eksperymentach na zwierzętach nie stosowano zaślepienia, a zwierzęta nie były randomizowane. W celu szczepienia młode i starsze myszy zaszczepiono przez wstrzyknięcie w poduszkę łapy 20 μl objętości 0,2 μg podwójnie inaktywowanej szczepionki SARS-CoV z ałunem lub próbnym PBS; myszom następnie podano dawkę przypominającą w tym samym schemacie 22 dni później i prowokowano 21 dni później.

Dla wszystkich grup, zgodnie z protokołem, zwierzęta monitorowano codziennie pod kątem klinicznych objawów choroby (garbienie, potargane futro i zmniejszona aktywność) przez czas trwania eksperymentu. Utratę masy ciała monitorowano codziennie przez pierwsze 7 dni, po czym monitorowanie masy kontynuowano, aż zwierzęta wróciły do ​​początkowej masy ciała lub wykazywały ciągły przyrost masy ciała przez 3 dni.

Wszystkie myszy, które straciły więcej niż 20% swojej początkowej masy ciała, były karmione ziemią i dalej monitorowane wiele razy dziennie, o ile znajdowały się poniżej 20% wartości granicznej. Myszy, które straciły ponad 30% początkowej masy ciała, natychmiast uśmiercano zgodnie z protokołem. Każda mysz uznana za umierającą lub mało prawdopodobną do wyzdrowienia była również humanitarnie uśmiercana według uznania badacza. Przeprowadzono eutanazję przy przedawkowaniu izofluranu, a śmierć potwierdzono przez zwichnięcie szyjki macicy. Wszystkie badania na myszach przeprowadzono na Uniwersytecie Północnej Karoliny (zapewnienie dobrostanu zwierząt nr A3410-01) przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i stosowania (IACUC) UNC.

Analiza histologiczna.

Lewe płuco usunięto i zanurzono w 10% buforowanej formalinie (Fisher) bez napełniania na 1 tydzień. Tkanki zatopiono w parafinie i przygotowano skrawki 5-μm przez ośrodek histopatologiczny UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Aby określić zakres barwienia antygenem, skrawki wybarwiono pod kątem antygenu wirusowego przy użyciu dostępnego w handlu poliklonalnego przeciwciała antynukleokapsydowego SARS-CoV (Imgenex) i zliczono w ślepy sposób przez barwienie dróg oddechowych i miąższu, jak opisano wcześniej20. Obrazy wykonano przy użyciu mikroskopu Olympus BX41 z aparatem Olympus DP71.

Testy neutralizacji wirusa.

Testy neutralizacji miana redukcji łysinek przeprowadzono z wcześniej scharakteryzowanymi przeciwciałami przeciwko SARS-CoV, jak opisano wcześniej11,

12,13

. W skrócie, neutralizujące przeciwciała lub surowicę seryjnie rozcieńczano dwukrotnie i inkubowano ze 100 p.f.u. różnych zakaźnych klonów, szczepów SARS-CoV przez 1 godzinę w 37°C. Wirus i przeciwciała następnie dodano do 6-studzienkowej płytki z 5 × 105 komórek Vero E6/studzienkę z wieloma powtórzeniami (n ≥ 2). Po 1-godzinnej inkubacji w 37°C, komórki pokryto 3 ml 0,8% agarozy w pożywce. Płytki inkubowano przez 2 dni w 37°C, barwiono obojętną czerwienią przez 3 godziny i liczono łysinki. Procent redukcji łysinek obliczono jako (1 – (liczba łysinek z przeciwciałem/liczba łysinek bez przeciwciała)) × 100.

Analiza statystyczna

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w przeciwstawnych dwóch grupach eksperymentalnych (albo dwa wirusy, albo kohorty zaszczepione i nieszczepione). W związku z tym istotne różnice w mianie wirusa i punktacji histologicznej określono za pomocą dwustronnego testu t-Studenta w poszczególnych punktach czasowych. Dane miały rozkład normalny w każdej porównywanej grupie i miały podobną wariancję.

Bezpieczeństwo biologiczne i bioasekuracja

Zgłoszone badania rozpoczęto po zatwierdzeniu protokołu eksperymentalnego przez instytucjonalny komitet ds. bezpieczeństwa biologicznego Uniwersytetu Północnej Karoliny (Tytuł projektu: Generowanie zakaźnych klonów nietoperzy SARS-podobnych CoV; Lab Safety Plan ID: 20145741; Schedule G ID: 12279).

Badania te rozpoczęto przed wstrzymaniem finansowania przez rząd USA Deliberative Process Research w sprawie wybranych badań nad uzyskaniem funkcji obejmujących wirusy grypy, MERS i SARS. Ten artykuł został zrecenzowany przez agencję finansującą, NIH. Zwrócono się o kontynuację tych badań, co zostało zatwierdzone przez NIH.

SARS-CoV jest agentem wyselekcjonowanym. Wszystkie prace związane z tymi badaniami przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonymi standardowymi procedurami operacyjnymi (SOP) i warunkami bezpieczeństwa dla SARS-CoV, MERs-CoV i innych powiązanych CoV. Nasze instytucjonalne placówki CoV BSL3 zostały zaprojektowane tak, aby spełniały wymagania bezpieczeństwa zalecane przez Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), Departament Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych, Public Health Service, Centers for Disease Control (CDC). ) i PZH. Plany bezpieczeństwa laboratorium zostały przedłożone, a obiekt został zatwierdzony do użytku przez Departament Zdrowia i Bezpieczeństwa Środowiskowego UNC (EHS) oraz CDC. Do wejścia do obiektu wymagany jest dostęp za pomocą karty elektronicznej.

Wszyscy pracownicy zostali przeszkoleni przez EHS w zakresie bezpiecznego korzystania z zasilanych respiratorów oczyszczających powietrze (PAPR), obowiązują odpowiednie nawyki pracy w obiekcie BSL3 oraz aktywne plany nadzoru medycznego. Nasze obiekty CoV BSL3 zawierają nadmiarowe wentylatory, awaryjne zasilanie wentylatorów oraz szafy i zamrażarki bezpieczeństwa biologicznego, a nasze obiekty mogą pomieścić stojaki na myszy SealSafe. Materiały sklasyfikowane jako czynniki BSL3 składają się z SARS-CoV, szczepów prekursorowych nietoperzy CoV, MERS-CoV oraz mutantów pochodzących od tych patogenów. W obiektach BSL3 eksperymenty z wirusem zakaźnym są przeprowadzane w certyfikowanej szafie bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC).

Wszyscy pracownicy noszą fartuchy, garnitury i fartuchy Tyvek, PAPR i pokrowce na buty, a ich ręce są w podwójnych rękawiczkach. Użytkownicy BSL3 podlegają planowi nadzoru medycznego monitorowanego przez Uniwersytecką Klinikę Zdrowia Zawodowego Pracowników (UEOHC), który obejmuje coroczne fizyczne, coroczne szczepienie przeciwko grypie i obowiązkowe zgłaszanie wszelkich objawów związanych z zakażeniem CoV w okresach pracy w BSL3. Wszyscy użytkownicy BSL3 są przeszkoleni w zakresie zarządzania ekspozycją i protokołami raportowania, są przygotowani do samodzielnej kwarantanny i zostali przeszkoleni w zakresie bezpiecznej dostawy do lokalnego działu zarządzania chorobami zakaźnymi w sytuacji awaryjnej. Wszystkie potencjalne zdarzenia narażenia są zgłaszane i badane przez EHS i UEOHC, a zgłoszenia składane są zarówno do CDC, jak i do NIH.


 

Kody akcesyjne
Przystąpienia
Bank danych białka
2AJF
Zmieniać historię
20 listopada 2015

W wersji tego artykułu opublikowanej początkowo online autorzy pominęli źródło finansowania USAID-EPT-PREDICT od EcoHealth Alliance dla Z.-L.S. Błąd został poprawiony w wersji drukowanej, PDF i HTML tego artykułu.


References

  1. Ge, X.Y. et al. Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor. Nature 503, 535–538 (2013).
  2. Yount, B. et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12995–13000 (2003).
  3. Becker, M.M. et al. Synthetic recombinant bat SARS-like coronavirus is infectious in cultured cells and in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 19944–19949 (2008).

  4. Peiris, J.S., Guan, Y. & Yuen, K.Y. Severe acute respiratory syndrome. Nat. Med. 10, S88–S97 (2004).
  5. Al-Tawfiq, J.A. et al. Surveillance for emerging respiratory viruses. Lancet Infect. Dis. 14, 992–1000 (2014).
  6. He, B. et al. Identification of diverse alphacoronaviruses and genomic characterization of a novel severe acute respiratory syndrome–like coronavirus from bats in China. J. Virol. 88, 7070–7082 (2014).
  7. Li, F. Receptor recognition and cross-species infections of SARS coronavirus. Antiviral Res. 100, 246–254 (2013).
  8. Sheahan, T. et al. Mechanisms of zoonotic severe acute respiratory syndrome coronavirus host range expansion in human airway epithelium. J. Virol. 82, 2274–2285 (2008).
  9. Yoshikawa, T. et al. Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection. PLoS ONE 5, e8729 (2010).
  10. Qiu, X. et al. Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with ZMapp. Nature 514, 47–53 (2014).
  11. Sui, J. et al. Broadening of neutralization activity to directly block a dominant antibody-driven SARS-coronavirus evolution pathway. PLoS Pathog. 4, e1000197 (2008).
  12. Sui, J. et al. Effects of human anti–spike protein receptor-binding domain antibodies on severe acute respiratory syndrome coronavirus neutralization escape and fitness. J. Virol. 88, 13769–13780 (2014).
  13. Rockx, B. et al. Escape from human monoclonal antibody neutralization effects in vitro and in vivo fitness of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J. Infect. Dis. 201, 946–955 (2010).
  14. Spruth, M. et al. A double-inactivated whole-virus candidate SARS coronavirus vaccine stimulates neutralizing and protective antibody responses. Vaccine 24, 652–661 (2006).
  15. Bolles, M. et al. A double-inactivated severe acute respiratory syndrome coronavirus vaccine provides incomplete protection in mice and induces increased eosinophilic proinflammatory pulmonary response upon challenge. J. Virol. 85, 12201–12215 (2011).
  16. Siegrist, C.-A. in Vaccines 6th edn. (eds. Plotkin, S.A., Orenstein, W.A. & Offit, P.A.) 14–32 (W.B. Saunders, 2013).
  17. Deming, D. et al. Vaccine efficacy in senescent mice challenged with recombinant SARS-CoV bearing epidemic and zoonotic spike variants. PLoS Med. 3, e525 (2006).
  18. Graham, R.L., Donaldson, E.F. & Baric, R.S. A decade after SARS: strategies for controlling emerging coronaviruses. Nat. Rev. Microbiol. 11, 836–848 (2013).
  19. Graham, R.L. & Baric, R.S. Recombination, reservoirs and the modular spike: mechanisms of coronavirus cross-species transmission. J. Virol. 84, 3134–3146 (2010).
  20. Agnihothram, S. et al. A mouse model for betacoronavirus subgroup 2c using a bat coronavirus strain HKU5 variant. MBio 5, e00047-14 (2014).
  21. Relman, D.A. Metagenomics, infectious disease diagnostics and outbreak investigations: sequence first, ask questions later? J. Am. Med. Assoc. 309, 1531–1532 (2013).
  22. Kaiser, J. Moratorium on risky virology studies leaves work at 14 institutions in limbo. ScienceInsider http://news.sciencemag.org/biology/2014/11/moratorium-risky-virology-studies-leaves-work-14-institutions-limbo (2014).
  23. Frieman, M. et al. Molecular determinants of severe acute respiratory syndrome coronavirus pathogenesis and virulence in young and aged mouse models of human disease. J. Virol. 86, 884–897 (2012).

  24. Ren, W. et al. Difference in receptor usage between severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus and SARS-like coronavirus of bat origin. J. Virol. 82, 1899–1907 (2008).

  25. Sims, A.C. et al. Release of severe acute respiratory syndrome coronavirus nuclear import block enhances host transcription in human lung cells. J. Virol. 87, 3885–3902 (2013).

  26. Fulcher, M.L., Gabriel, S., Burns, K.A., Yankaskas, J.R. & Randell, S.H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183–206 (2005).

  27. Roberts, A. et al. A mouse-adapted SARS-coronavirus causes disease and mortality in BALB/c mice. PLoS Pathog. 3, e5.

Download references


Podziękowanie

Badania w tym manuskrypcie były finansowane z grantów Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych oraz Narodowego Instytutu Starzenia się Narodowego Instytutu Zdrowia Stanów Zjednoczonych (NIH) w ramach nagród U19AI109761 (RSB), U19AI107810 (RSB), AI085524 (WAM), F32AI102561 (VDM) i K99AG049092 (VDM) oraz przyznane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych w Chinach 81290341 (Z.-LS) i 31470260 (X.-YG) oraz przez finansowanie USAID-EPT-PREDICT z EcoHealth Alliance (Z. -LS). Hodowle ludzkiego nabłonka dróg oddechowych były wspierane przez Narodowy Instytut Cukrzycy oraz Chorób Układu Pokarmowego i Nerek NIH nagrodą NIH DK065988 (S.H.R.). Dziękujemy również M.T. Ferris (Wydział Genetyki, Uniwersytet Karoliny Północnej) za przegląd podejść statystycznych i C.T. Tseng (Departament Mikrobiologii i Immunologii, Oddział Medyczny Uniwersytetu Teksańskiego) za dostarczenie komórek Calu-3. Eksperymenty z pełnej długości i chimerycznymi rekombinowanymi wirusami SHC014 rozpoczęto i przeprowadzono przed wstrzymaniem finansowania badań przez GOF i od tego czasu zostały zweryfikowane i zatwierdzone do dalszych badań przez NIH. Za treść odpowiadają wyłącznie autorzy i niekoniecznie reprezentują oficjalne poglądy PZH.


Informacje o autorze
Afiliacje
Department of Epidemiology, University of North Carolina w Chapel Hill, Chapel Hill, North Carolina, USA
Vineet D Menachery
, Boyd L Young Jr
, Kari Debbink
, Lisa E. Graliński
, Jessica A Plante
, Rachel L. Graham
Trevor Scobey
, Eric F. Donaldson
& Ralph S Baric
Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina w Chapel Hill, Chapel Hill, North Carolina, USA
Kari Debbink
& Ralph S Baric
Narodowe Centrum Badań Toksykologicznych, Agencja Żywności i Leków, Jefferson, Arkansas, USA,
Sudhakar Agnihothram
Kluczowe Laboratorium Patogenów Specjalnych i Bezpieczeństwa Biologicznego, Instytut Wirusologii Wuhan, Chińska Akademia Nauk, Wuhan, Chiny
Xing-Yi Ge
& Zhengli-Li Shi
Wydział Biologii i Fizjologii Komórki, Uniwersytet Karoliny Północnej w Chapel Hill, Chapel Hill, Karolina Północna, USA
Scott H. Randell
Centrum Mukowiscydozy, Marsico Lung Institute, University of North Carolina w Chapel Hill, Chapel Hill, North Carolina, USA
Scott H. Randell
Institute for Research in Biomedicine, Bellinzona Institute of Microbiology, Zurych, Szwajcaria
Antonio Lanzavecchia
Department of Cancer Immunology and AIDS, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA
Wayne A Marasco
Department of Medicine, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA
Wayne A Marasco
Składki

VDM zaprojektował, skoordynował i wykonał eksperymenty, ukończył analizę i napisał rękopis. B.L.Y. zaprojektował zakaźny klon i odzyskane wirusy chimeryczne; S.A. zakończyła testy neutralizacji; NOGA. pomagał w przeprowadzaniu eksperymentów na myszach; T.S. i J.A.P. zakończone eksperymenty na myszach i testy łysinkowe; X.-Y.G. przeprowadził eksperymenty pseudotypowania; K.D. wygenerowane dane strukturalne i prognozy; E.F.D. wygenerowana analiza filogenetyczna; R.L.G. ukończona analiza RNA; SHR dostarczyły pierwotne kultury HAE; A.L. i W.A.M. dostarczyli krytyczne odczynniki przeciwciał monoklonalnych; i Z.-L.S. dostarczyli sekwencje wypustek i plazmidy SHC014. R.S.B. zaprojektował eksperymenty i napisał rękopis.

Korespondenci autorzy

Korespondencja z Vineet D Menachery lub Ralph S Baric.

Deklaracje etyczne
Konkurujące interesy

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Supplementary Text and Figures

Rysunki uzupełniające 1–6 i tabele uzupełniające 1–4 (PDF 4747 kb)

Przedruki i uprawnienia

Cytuj ten artykuł

V. Menachery, B. Yount, K. Debbink i in. Podobne do SARS skupisko krążących koronawirusów nietoperzy wykazuje potencjał do pojawienia się człowieka. Nat Med 21, 1508-1513 (2015). https://doi.org/10.1038/nm.3985

Download citation

Otrzymano12 czerwca 2015
Zaakceptowano08 października 2015
Opublikowano09 listopada 2015
Data wydaniaGrudzień 2015

Source:  Free Download MP3 of OUT OF CONTROL on SoundCloud.com


:ABY UDOSTĘPNIĆ TEN ARTYKUŁ NA FACEBOOKU, SKOPIUJ i WKLEJ ten link  https://www.veteranstodaynetwork.com/2020/04/29/documentary-proof-university-of-north-carolina-generated-covid-19/


  • Źródła:

    Podobne do SARS skupisko krążących koronawirusów nietoperzy wykazuje potencjał do pojawienia się człowieka
    Izolacja i charakterystyka koronawirusa podobnego do SARS nietoperza, który wykorzystuje receptor ACE2
    Ciężki zespół ostrej niewydolności oddechowej
    Odwrócenie zaawansowanej choroby wirusowej Ebola u naczelnych innych niż człowiek za pomocą ZMapp
    Dziesięć lat po SARS: strategie kontrolowania pojawiających się koronawirusów


https://www.veteranstoday.com/2021/06/20/pravda-us-army-created-covid-19-in-2015-research-proofs-or-debunking-you-pick/

CZERWONE

Witryna wykorzystuje Akismet, aby ograniczyć spam. Dowiedz się więcej jak przetwarzane są dane komentarzy.

ODBLOKUJ TREŚCI I STREAM KLIKAJĄC W PONIŻSZY OBRAZEK PEŁNA INSTRUKCJA  + MATERIAŁ FILMOWY !! 

Holler Box

KORZYSTASZ Z OGRANICZONEGO CZASOWO DOSTĘPU !!

DALSZE KORZYSTANIE ZE STRONY MOŻLIWE PO URUCHOMIENIU DOSTĘPU PREMIUM 

 

STREAM PONIEDZIAŁEK , WTOREK, ŚRODA , CZWARTEK 21.00 - SOBOTA 20.00

ABY TA BLOKADA STRONY BYŁA DLA CIEBIE NIE WIDOCZNA ZAŁÓŻ KONTO I ZALOGUJ SIĘ INSTR. FILMOWA PONIŻEJ :-)

ODBLOKUJ TREŚCI I STREAM KLIKAJĄC W PONIŻSZY OBRAZEK PEŁNA INSTRUKCJA  + MATERIAŁ FILMOWY !! 

Holler Box
%d bloggers like this: