NAJCZĘŚCIEJ CZYTANE
Przeczytaj koniecznie!Dr.G.Vanden Bossche ostrzega wszystkie kraje przed masowymi szczepieniami.
Skandal w Niemczech !!  Uniwersytet w Ulm przebadał szczepionki..
RAPORT COVIDOWY - TRAGEDIA NARODU POLSKIEGO - Paweł Klimczewski  ekspert analizy danych spolecznych i demograficznych, PSNLiN
Lekarz przerywa milczenie: poważne skutki uboczne, dzieci i osoby starsze zagrożone
   POLITYKA STRONY M-FORUM !!! - WSZYSTKIE ZAMIESZCZANE MATERIAŁY ORAZ PREZENTOWANE I PROPAGOWANE - Poglądy i opinie zawarte w artykułach mogą być niezgodne ze stanowiskiem redakcji. !!!! REDAKCJA M-FORUM AV LIVE MA NA CELU PUBLIKOWANIE WSZYSTKICH INFORMACJI KTÓRE SĄ CENZUROWANE BEZ WZGLĘDU NA ZABARWIENIA POLITYCZNE , RELIGIJNE I OBYCZAJOWE - ZA KOMENTARZE I WYPOWIEDZI CZYTELNIKÓW I WIDZÓW NIE BIERZE ODPOWIEDZIALNOŚCI , Z WYJĄTKIEM TREŚCI O CHARAKTERZE PRZESTĘPCZYM KTÓRE BĘDĄ USUWANE BEZ OSTRZEŻEŃ     UWAGA !! WAŻNE - Poglądy i opinie zawarte w artykule mogą być niezgodne ze stanowiskiem redakcji. Zamieszczane artykułu są w wiekszości re- publikacjami materiałów z innych stron - REDAKCJA NIE INGERUJE W ICH TREŚCI W CELU ZACHOWANIA BEZSTRONNOŚCI , A CELEM PUBLIKACJI JEST PODDANIE TYCH MATERIAŁÓW POD OSĄD I KRYTYKĘ CZYTELNIKÓW W KTÓRE OPINIE NIE MOŻE INGEROWAĆ AUTOR MATERIAŁU W FORMIE MODERACJI LUB CENZURY

M-forum A.V Live.

TO PORTAL NA KTÓRYM CODZIENNIE ZNAJDZIESZ PONAD 100 INFORMACJI INFO NIUS W TYM MATERIAŁY CENZUROWANE LUB ZABRONIONE NA INNYCH PORTALACH POPRAWNYCH POOLITYCZNIE

CZERWONE

Białko S1 SARS-CoV-2 przekracza barierę krew-mózg u myszy

The following two tabs change content below.

Gabi

Witam, nazywam się Gabriela Nowak, pracuję jako asystentka  zarządzania i obsługi Klienta w Kancelarii Prawnej,  niedawno w kwietniu 2019 r zostałam Przewodnicząca Komisji Skrutacyjnej w Radzie Miasta - gdzie czynnie reprezentuję interesy mieszkańców, którzy mi zaufali i mnie wybrali ! STOP CENZURZE   UWAŻASZ, ŻE CENZURA - ŁAMIE TWOJE PRAWA RP ?  WESPRZYJ MNIE - W TYM CO ROBIĘ - ♛  z dopiskiem - DAROWIZNA  ! Nest Bank Polska 75187010452078115029220001  Nest Bank zagranica IBAN PL75187010452078115029220001  Kod SWIFT Nest Bank: NESBPLPW   Dziękuję, $$$ Pozdrawiam i zapraszam do komentowania !   ♡♡♡ ZOBACZ TAKŻE POMAGAM ♡♡♡  https://zrzutka.pl/gc97mb
Białko S1 SARS-CoV-2 przekracza barierę krew-mózg u myszy

Białko S1Białko S1 SARS-CoV-2 jest niebezpieczne dla ludzi

streszczenie

Nie jest jasne, czy koronawirus zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2, który powoduje chorobę koronawirusową 2019, może zaatakować mózg. Koronawirus 2 ciężkiego ostrego zespołu oddechowego wiąże się z komórkami za pośrednictwem podjednostki S1 białka kolczastego. Pokazujemy, że dożylnie wstrzyknięty jod radioaktywny S1 (I-S1) z łatwością przekracza barierę krew-mózg u samców myszy, jest wychwytywany przez regiony mózgu i wchodzi do przestrzeni miąższowej mózgu. I-S1 został również przejęty przez płuca, śledzionę, nerki i wątrobę. I-S1 podany donosowo również dotarł do mózgu, aczkolwiek w około dziesięciokrotnie niższych stężeniach niż po podaniu dożylnym. Genotyp i płeć APOE nie wpływały na wychwyt I-S1 w całym mózgu, ale miał zmienny wpływ na wychwyt w opuszce węchowej, wątrobie, śledzionie i nerkach. Wychwyt I-S1 w hipokampie i opuszce węchowej został zmniejszony przez zapalenie wywołane lipopolisacharydem. Badania mechanistyczne wykazały, że I-S1 przenika przez barierę krew-mózg poprzez transcytozę adsorpcyjną, a mysi enzym konwertujący angiotensynę 2 bierze udział w wychwytywaniu w mózgu i płucach, ale nie w nerkach, wątrobie lub śledzionie .

Wielka ilość

Koronawirus 2 ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV-2) jest odpowiedzialny za pandemię choroby koronawirusowej (COVID-19) w 2019 roku. Oprócz zapalenia płuc i ostrej duszności, COVID-19 wiąże się z szeregiem objawów wpływających na OUN, w tym utratą smaku i węchu, bólem głowy, drganiami, drgawkami, splątaniem, zaburzeniami widzenia, nerwobólami, zawrotami głowy, zaburzeniami świadomości, nudności i wymioty, porażenie połowicze, ataksja , Udar mózgu i krwotok mózgowy. Postulowano, że niektóre objawy COVID-19 mogą być spowodowane bezpośrednią ekspozycją wirusa na OUN; tak może z. Na przykład objawy oddechowe można częściowo przypisać temu, że SARS-CoV-2 przenika do ośrodków oddechowych mózgu. W przypadku COVID-19 zgłaszano również zapalenie mózgu, które może być wynikiem przedostawania się wirusów lub białek wirusowych do mózgu. mRNA SARS-CoV-2 uzyskano z płynu mózgowo-rdzeniowego, co sugeruje, że może on przekraczać barierę krew-mózg (BBB). Inne koronawirusy, w tym blisko spokrewniony wirus SARS, który spowodował wybuch epidemii w latach 2003-2004, są w stanie przekroczyć BBB, a SARS-CoV-2 może infekować neurony w modelu BrainSphere. Jednak SARS-CoV-2 może wywoływać zmiany w OUN bez bezpośredniego przekraczania BBB, ponieważ COVID-19 jest związany z burzą cytokin, a wiele cytokin przechodzi przez BBB, aby wpływać na funkcję OUN. sugerując, że może przekraczać barierę krew-mózg (BBB). Inne koronawirusy, w tym blisko spokrewniony wirus SARS, który spowodował wybuch epidemii w latach 2003-2004, są w stanie przekroczyć BBB, a SARS-CoV-2 może infekować neurony w modelu BrainSphere. Jednak SARS-CoV-2 może wywoływać zmiany w OUN bez bezpośredniego przekraczania BBB, ponieważ COVID-19 jest związany z burzą cytokin, a wiele cytokin przechodzi przez BBB, aby wpływać na funkcję OUN. sugerując, że może przekraczać barierę krew-mózg (BBB). Inne koronawirusy, w tym blisko spokrewniony wirus SARS, który spowodował wybuch epidemii w latach 2003-2004, są w stanie przekroczyć BBB, a SARS-CoV-2 może infekować neurony w modelu BrainSphere. Jednak SARS-CoV-2 może wywoływać zmiany w OUN bez bezpośredniego przekraczania BBB, ponieważ COVID-19 jest związany z burzą cytokin, a wiele cytokin przechodzi przez BBB, aby wpływać na funkcję OUN.

Tutaj badamy, czy białko wirusowe z SARS-CoV-2, białko spike-1 (S1), może przejść przez BBB. Po pierwsze, wykazano, że niektóre białka wydzielane przez wirusy przenikają przez BBB, wywołują zapalenie nerwów i w inny sposób zaburzają funkcje OUN. Po drugie, białko wirusowe, które wiąże się z komórkami, można wykorzystać jako model aktywności wirusa; innymi słowy, jeśli wirusowe białko wiążące przechodzi przez BBB, jest prawdopodobne, że to białko umożliwi również wirusowi przejście przez BBB. S1 jest białkiem wiążącym SARS-CoV-2; wiąże się z enzymem konwertującym angiotensynę 2 (ACE2) 21,22,23 i prawdopodobnie także z innymi białkami.

W tym badaniu pokazujemy, że I-S1 łatwo przechodził przez mysią BBB, wnikał do tkanki miąższowej mózgu i, w mniejszym stopniu, był sekwestrowany przez komórki śródbłonka mózgu i związany z glikokaliksem naczyń włosowatych mózgu. Opisujemy szybkość wnikania I-S1 do mózgu po podaniu dożylnym (iv) i donosowym, określamy jego wychwyt w 11 różnych obszarach mózgu, badamy wpływ stanu zapalnego, genotyp APOE i płeć na transport I-S1 oraz porównujemy I-S1 Wychwyt -S1 w mózgu z wychwytem w wątrobie, nerkach, śledzionie i płucach. Na podstawie eksperymentów z glikoproteiną WGA stwierdziliśmy, że wejście I-S1 do mózgu prawdopodobnie zachodzi poprzez zależny od pęcherzyków mechanizm transcytozy adsorpcyjnej.

    Wyniki

Białko I-S1 jest transportowane przez barierę krew-mózg myszy

Białka S1 uzyskaliśmy z dwóch komercyjnych źródeł: RayBiotech i AMSBIO. Białka S1 znakowano wewnętrznie radioaktywnie i sprawdzano, czy są nienaruszone po znakowaniu żelami autoradiograficznymi. Zbadaliśmy, czy dożylnie wstrzyknięty I-S1 może przezwyciężyć BBB u myszy, mierząc jego stałą napływu krew-mózg (Ki) przy użyciu analizy regresji wielokrotnej (MTRA). MTRA wykreśla stosunki tkanka/surowica dla I-S1 w funkcji czasu ekspozycji, który jest miarą czasu skorygowaną o klirens I-S1 z krwi. Nachylenie części liniowej tego wykresu mierzy Ki, czyli jednokierunkową stałą dopływu dla I-S1.

Wraz z I-S1 wstrzyknęliśmy albuminę znakowaną 99mTc (T-Alb). T-Alb nie przenika słabo przez nienaruszoną BBB i dlatego może być stosowany do pomiaru przestrzeni naczyniowej mózgu. Każdy stosunek mózg/surowica dla I-S1, który przekracza stosunek mózg/surowica dla T-Alb, reprezentuje pozanaczyniowy I-S1, tj. materiał, który przeszedł przez BBB. T-Alb może być również używany do pomiaru przecieku z łożysk tkanek obwodowych i BBB, który został zagrożony przez chorobę lub stan zapalny.

Wartości Ki białek I-SI z dwóch źródeł różniły się o około 3%. Wyniki te pokazują, że w przeciwieństwie do T-Alb, I-S1 może z łatwością pokonać mysiego BBB.

I-S1 jest wydalany z krwi i wchłaniany przez tkanki obwodowe

Ustaliliśmy klirens RayBiotecha wstrzykniętego dożylnie I-S1 z krwi i jego wychwyt w mózgu i innych tkankach, ponownie używając radiogramów. Klirens I-S1 z krwi był liniowy przez pierwsze 10 minut, z okresem półtrwania klirensu wynoszącym około 6,6 minuty, po którym następował plateau. Te stosunki „delta” tkanka/surowica zostały zatem skorygowane dla I-S1 w przestrzeni naczyniowej i dla każdego I-S1, który dostałby się do tkanki z powodu nieszczelnego łożyska kapilarnego. Uzyskane wartości delta reprezentują zatem specyficzny wychwyt I-S1 przez tkanki.

Wszystkie tkanki wykazały wychwyt I-S1. Wychwyt w śledzionie i wątrobie był nieliniowy, co sugeruje, że ich łożyska tkankowe są w równowadze z krwią. Większość substancji we krwi jest rozkładana przez nerki lub wątrobę; znacznie wyższy wychwyt I-S1 w wątrobie w porównaniu z nerkami sugeruje, że I-S1 jest rozkładany głównie z krwi przez wątrobę. Aby ustalić, czy istnieją regionalne różnice w wychwytywaniu I-S1 w mózgu, usunęliśmy opuszkę węchową i rozcięliśmy cały mózg na dziesięć obszarów. Odkryliśmy, że I-S1 był pobierany we wszystkich regionach mózgu, bez statystycznie istotnych różnic między regionami.

W podobny sposób określiliśmy klirens I-S1 (AMSBIO) z krwi i jego wychwyt w mózgu i innych tkankach. Wyniki były podobne do tych uzyskanych z I-S1 pochodzącego z RayBiotech, ale było kilka różnic. Pochodzący z AMSBIO I-S1 był szybciej usuwany z krwi (okres półtrwania 3,6 min), a tempo wychwytu przez wątrobę było prawie pięć razy szybsze niż wychwyt wątrobowy I-S1 pochodzącego z RayBiotech (P <0,0001) . Podsumowując, wyniki te pokazują, że I-S1 jest rozkładany z krwi głównie przez wątrobę i że S1 ma dostęp do innych tkanek istotnych dla COVID-19, w tym nerek, płuc i śledziony.

 I-S1 jest stabilny w mózgu i krwi

Zmierzyliśmy stabilność dożylnego I-S1 firmy RayBiotech we krwi i mózgu za pomocą wytrącania kwasem. I-S1 dodany do tkanek (kontrole przetwarzania) ex vivo wykazywał niewielką degradację. Radioaktywność odzyskana z mózgu 10 minut po wstrzyknięciu iv iz surowicy 10 i 30 minut po wstrzyknięciu iv I-S1 była stabilna, przy czym większość radioaktywności była wytrącona kwasem. Większość radioaktywności odzyskanej z mózgu 30 minut po dożylnym wstrzyknięciu I-S1 była w dużej mierze wyczerpana. Sugeruje to, że I-S1 wchodzi do BBB w stanie nienaruszonym, ale ostatecznie ulega rozkładowi w mózgu, chociaż nie jest jasne, czy wiąże się to z odszczepieniem radioaktywnego jodu od I-S1 i/lub czy samo białko S1 jest rozkładane.

W rzadkich przypadkach substancje, które wydają się przechodzić przez BBB, są w rzeczywistości usuwane z łożyska naczyń włosowatych, uniemożliwiając im przedostanie się do miąższu mózgu / przestrzeni płynu śródmiąższowego. Dlatego zbadaliśmy następnie, czy wstrzyknięty dożylnie I-S1 całkowicie przeszedł przez ścianę naczyń włosowatych, aby dostać się do miąższu mózgu. W tym celu zastosowaliśmy zmodyfikowaną wersję metody „deplecji kapilarnej”, która umożliwiła nam również zmierzenie ilości wstrzykniętego dożylnie I-S1, który odwracalnie przylega do strony światła łożyska kapilarnego. Odkryliśmy, że wiązanie I-S1 ze stroną światła pozostawało z czasem statyczne, podczas gdy ilość I-S1 zatrzymanego przez naczynia włosowate mózgu nieznacznie wzrosła z czasem. Największą zmianę w czasie zaobserwowano w ilości I-S1 wchodzącej do miąższu. Wyniki te pokazują, że po 30 minutach ponad 50% I-S1 całkowicie przekroczyło ścianę naczyń włosowatych, aby dostać się do miąższowych i śródmiąższowych przestrzeni płynowych mózgu.

WGA zwiększa wychwyt I-S1 w mózgu i niektórych tkankach obwodowych

Agglutynina z kiełków pszenicy (WGA) to lektyna pochodzenia roślinnego, która pokonuje BBB poprzez transcytozę adsorpcyjną24 – proces, w którym białka lub peptydy wiążą się z glikoproteinami na powierzchni światła komórek śródbłonka, są internalizowane w pęcherzykach, a następnie transportowane przez błonę. W WGA transcytoza adsorpcyjna występuje, gdy WGA wiąże się z glikoproteinami na powierzchni komórek, które zawierają kwas sialowy i N-acetyloglukozaminę. Wiele białek wirusowych wiąże się również z glikoproteinami zawierającymi kwas sialowy i N-acetyloglukozaminę, a zatem wstrzyknięcie WGA z takimi białkami wirusowymi zwiększa ich transport przez BBB i wychwyt do tkanek obwodowych18. Tutaj odkryliśmy, że wychwyt dożylnie wstrzykiwanego I-S1 (RayBiotech lub AMSBIO) był zwiększony w mózgu, płucach, śledzionie i nerkach, czy WGA był dołączony do wtrysku. Jednoczesne wstrzyknięcie WGA zwiększyło również klirens I-S1 (RayBiotech), ale nie I-S1 (AMSBIO), o czym świadczy spadek I-S1 we krwi. Jednoczesne wstrzyknięcie WGA zmniejszyło wychwyt I-S1 (AMSBIO), ale nie I-S1 (RayBiotech) w wątrobie, chociaż w innym eksperymencie zmniejszyło wychwyt I-S1 (RayBiotech) w wątrobie.

Wyniki te silnie sugerują, że I-S1 przechodzi przez BBB i łożyska tkanek obwodowych poprzez mechanizm transcytozy adsorpcyjnej przez wiązanie się z glikoproteinami powierzchniowymi zawierającymi kwas sialowy lub N-acetyloglukozaminę.

Heparyna blokuje wychwyt I-S1 w wątrobie, ale nie w mózgu

Niektóre wirusy wykorzystują siarczan heparanu na błonie komórkowej jako receptor25. Heparyna może blokować wychwyt wirusa w tkankach, prawdopodobnie przez wiązanie się z białkami wirusowymi i blokowanie wiązania tych białek wirusowych z siarczanem heparanu na błonach komórkowych. Stwierdziliśmy jednak, że heparyna wstrzykiwana jednocześnie z I-S1 nie wpływa na wychwyt I-S1 (RayBiotech) w mózgu, płucach, śledzionie lub nerkach i nie wpływa na wpływ jednoczesnego wstrzykiwania WGA na I-S1 wychwyt w tych tkankach (dane niepokazane). Heparyna wstrzyknięta z I-S1 blokowała wychwyt I-S1 w wątrobie, co prawdopodobnie wyjaśnia obserwowany zmniejszony klirens I-S1 z krwi, ale nie blokowało wpływu WGA na wchłanianie I-S1 w wątrobie. Te wyniki sugerują
Wychwyt I-S1 do mózgu nie był blokowany przez nieoznakowany S1

Następnie zbadano, czy transport dożylnie wstrzykniętego I-S1 (RayBiotech) do mózgu może zostać zablokowany przez dodanie do wstrzyknięcia nadmiaru nieznakowanego białka S1 (AMSBIO). Nieznakowany S1 nie wpływał na stosunek mózg/surowica dla delta I-S1 w żadnej z badanych dawek (ryc. 5a), chociaż zwiększał wychwyt I-S1 w płucach. Sugeruje to, że miejsce wiązania I-S1 w tkance mózgowej nie jest łatwo nasycone – cecha transcytozy adsorpcyjnej. Nieznakowany S1 również nie wpływał na stosunek mózg/surowica dla T-Alb (dane nieprzedstawione), co wskazuje, że nawet wysoka dawka (10 μg) S1 nie zaburza ostro BBB.

ACE2 prawdopodobnie pośredniczy w wychwytywaniu I-S1 w mózgu i płucach, ale nie w innych tkankach

Zdolność SARS-CoV-2 do penetracji komórek prawdopodobnie zależy od wiązania białka S z enzymem związanym z błoną (i glikoproteiną) ACE2. Aby określić, czy ACE2 odgrywa rolę w wychwytywaniu I-S1 w mózgu i tkankach obwodowych, wstrzyknęliśmy dożylnie ludzkie ACE2 lub substraty ACE2 Ang II i grelinę wraz z I-S1 (RayBiotech). Nie wpłynęło to na poziomy we krwi wstrzykniętego dożylnie I-S1 lub T-Alb (dane nie pokazane), co wskazuje, że białka te nie wpływają na objętość dystrybucji lub klirens I-S1 lub albuminy. Jednoczesne wstrzyknięcie ACE2 zwiększyło poziom wstrzykniętego dożylnie T-Alb w nerkach: F (4,36) = 2,63, P = 0,0505; Nośnik: 119 ± 4,4 ul g-1 (n = 8 myszy); ACE2: 151 ± 15,6 μL g-1 (n = 8 myszy, P = 0,02), prawdopodobnie wskazujące że ACE2 wpływa na klirens nerkowy albuminy. Jedynie jednoczesne wstrzyknięcie ACE2 zwiększyło wychwyt I-S1 w mózgu. Wychwyt w płucach był zwiększony przez jednoczesne wstrzyknięcie S1, greliny lub ACE2, ale nie angiotensyny II, podczas gdy wychwyt przez wątrobę, nerki lub śledzionę nie uległ zmianie po wstrzyknięciu którejkolwiek z tych substancji (dane nieprzedstawione). Wyniki te sugerują, że ACE2 bierze udział w wychwytywaniu S1 w płucach i prawdopodobnie w mózgu, ale nie w wychwytywaniu I-S1 w śledzionie, wątrobie lub nerkach. Nerki lub śledziona nie uległy zmianie przez jednoczesne wstrzyknięcie żadnej z tych substancji (dane nie pokazane). Wyniki te sugerują, że ACE2 bierze udział w wychwytywaniu S1 w płucach i prawdopodobnie w mózgu, ale nie w wychwytywaniu I-S1 w śledzionie, wątrobie lub nerkach. Nerki lub śledziona nie uległy zmianie przez jednoczesne wstrzyknięcie żadnej z tych substancji (dane nie pokazane). Wyniki te sugerują, że ACE2 bierze udział w wychwytywaniu S1 w płucach i prawdopodobnie w mózgu, ale nie w wychwytywaniu I-S1 w śledzionie, wątrobie lub nerkach.
Stan zapalny zwiększa wychwyt I-S1 w mózgu i płucach

Ponieważ infekcja SARS-CoV-2 wywołuje stan zapalny, zbadaliśmy następnie, czy stan zapalny – w tym przypadku wywołany przez wstrzyknięcie lipopolisacharydu (LPS) – wychwyt dożylnie wstrzykniętego I-S1 (RayBiotech) w mózgu i obwodzie dotknięte tkanki. Myszy otrzymały wstrzyknięcie 3 mg kg-1 LPS otrzymanego z Salmonella typhimurium (Sigma) w t = 0 i ponownie 6 i 24 godziny później, i otrzymały wstrzyknięcie iv I-S1 plus T-Alb 28 godzin po pierwszym wstrzyknięciu LPS; to leczenie LPS może zakłócić BBB, zwiększyć jego przepuszczalność dla wirusów i białek wirusowych27,28 oraz zwiększyć poziomy we krwi wielu cytokin, które są podwyższone podczas burzy cytokin związanej z COVID-19.

Odkryliśmy, że LPS nie wpływa na poziom T-Alb we krwi, co sugeruje, że stan zapalny nie powodował u tych myszy skurczu objętości naczyń ani wycieku z łożysk naczyń włosowatych obwodowych. Myszy, które otrzymały LPS miały wyższe poziomy I-S1 w surowicy, co sugeruje zmniejszony klirens krwi (prawdopodobnie ze względu na zmniejszony wychwyt I-S1 w wątrobie obserwowany u tych myszy, jak również wyższy stosunek T-Alb mózg/surowica, który wskazuje na przerwanie BBB (kontrola : 8,52 ± 0,19 μl g-1 (n = 10); LPS: 12,2 ± 0,68 μl g-1 (n = 8), t = 5,74, P <0,0001 Te myszy miały również wyższy stosunek I-S1 mózg/surowica ( tj. proporcje, które nie były dla I-S1 w przestrzeni naczyniowej i dla wejścia I-S1- Brain skorygowane z powodu przecieku), co wskazuje na zwiększony pasaż I-S1 przez BBB (kontrola: 12,06 ± 0,26 μl g-1 (n = 10); LPS: 14,9 ± 0,64 μl g-1 (n = 8 ), t = 4,38, p = 0,0005) , chociaż stosunki delta mózg/surowica dla I-S1 (tj. stosunki skorygowane) nie różniły się od kontroli (z wyjątkiem opuszki węchowej). Jedyną tkanką obwodową, która wykazywała zwiększony wychwyt I-S1 po otrzymaniu LPS, były płuca, gdzie wychwyt był zwiększony o 101%. Wyniki te wskazują, że stan zapalny może zwiększyć toksyczność S1 dla tkanki płucnej poprzez zwiększony wychwyt. Wyniki pokazują również, że u myszy stan zapalny może zwiększyć wnikanie dożylnie wstrzykniętego I-S1 do mózgu, ale jest to prawdopodobnie spowodowane zaburzeniem BBB, a nie wzrostem transcytozy absorpcyjnej.

I-S1 wchodzi do mózgu i krwi myszy po podaniu donosowym

Niektóre wirusy mogą dostać się do mózgu przez nerw węchowy, nerw czaszkowy z wypustkami przez płytkę sitowatą30. Inne wirusy mogą przechodzić przez BBB po dostaniu się do krwiobiegu z przedziału nosowego. Nie jest jasne, czy SARS-CoV-2 może dostać się do mózgu jedną z tych dróg w nosie. Zbadaliśmy zatem zdolność I-S1 podawanego donosowo do wchodzenia do mózgu. Po wstrzyknięciu 1 µl roztworu nośnika zawierającego I-S1 do każdego kanału nosowego na poziomie płytki sitowej (gdzie nerw węchowy wyłania się ze sklepienia czaszki), I-S1 wykryto we wszystkich obszarach mózgu. Poziomy I-S1 w całym mózgu, korze czołowej, móżdżku, śródmózgowiu i rdzeniu rdzenia były większe niż 10 minut po 30 minutach od podania. Dystrybucja I-S1 w mózgu była w dużej mierze jednorodna, chociaż poziomy w opuszce węchowej i podwzgórzu były wyższe 10 minut po podaniu niż w innych obszarach mózgu, a także w opuszce węchowej 30 minut po podaniu. Stężenia I-S1 w całym mózgu, wyrażone jako procent podanej dawki, były około dziesięciokrotnie wyższe po wstrzyknięciu dożylnym niż po wstrzyknięciu donosowym. Radioaktywność pojawiła się we krwi po donosowym podaniu I-S1, wskazując, że pewna ilość I-S1 dostała się do krwiobiegu (dane nie pokazane). Pole pod krzywą (AUC) dla I-S1 we krwi po podaniu donosowym wynosiło 9,42 (% wstrzyknięcie ml-1 min-1), podczas gdy AUC dla I-S1 we krwi po wstrzyknięciu dożylnym wynosiło 1,430 (% wstrzyknięcie ml -1 min-1), co sugeruje, że biodostępność dla drogi nosowej wynosiła 0,66%. Podsumowując, wyniki te pokazują, że I-S1 może przenikać do mózgu i po podaniu donosowym rozprzestrzeniać się do wszystkich obszarów mózgu w sposób zależny od czasu. Jednak wychwyt I-S1 w mózgu tą drogą jest znacznie mniej wydajny niż wychwyt po transporcie przez BBB.

Wpływ płci i genotypu APOE na wychwyt I-S1

Płeć męska i genotyp APOE4 w porównaniu z genotypem APOE3 są czynnikami ryzyka zarówno choroby, jak i złego przebiegu COVID-19. Dlatego określiliśmy pobieranie dożylnie wstrzykniętego I-S1 (RayBiotech) lub T-Alb u samców i samic myszy wyrażających ludzkie APOE3 lub APOE4 z ekspresją mysiego promotora ApoE. Genotyp i płeć APOE nie miały wpływu na stosunek T-Alb mózg/surowica. Dwukierunkowa analiza ANOVA wykazała wpływ płci na wychwyt I-S1 w opuszce węchowej i śledzionie oraz wpływ genotypu APOE na wychwyt I-S1 w wątrobie, śledzionie i nerkach. Wielokrotne testy porównawcze wykazały, że w porównaniu z pozostałymi trzema grupami samce myszy z ekspresją ludzkiego APOE3 miały najszybszy wychwyt I-S1 w opuszce węchowej, w wątrobie i nerkach, podczas gdy w porównaniu z pozostałymi trzema grupami, samice myszy z ekspresją ludzkiego APOE3 miały najszybszy wychwyt I-S1 w śledzionie. Wyniki te sugerują, że zwiększony wychwyt I-S1 w niektórych tkankach może przyczyniać się do zwiększonego ryzyka COVID-19 u mężczyzn w porównaniu z kobietami, ale nie do ryzyka związanego z genotypem APOE4.

Transport I-S1 przez model in vitro BBB

Aby określić, czy I-S1 krzyżuje się z komórkami podobnymi do śródbłonka w modelu ludzkiego BBB in vitro, porównaliśmy transport I-S1 z transportem T-Alb przez monowarstwy ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) uzyskanych ze śródbłonka podobne do komórek mózgu (iBEC) i zostały zasiane na Transwells. Trzy niezależne eksperymenty wykazały, że szybkość pasażu I-S1 (RayBiotech) w kierunku od światła do abluminu w porównaniu z T-Alb nie była statystycznie istotna. Eksperyment wykazał, że nieznakowany S1 nie hamował pasażu I-S1 (RayBiotech). WGA nie miało też wpływu na transport RayBiotech I-S1. I-S1 (RayBiotech) miał istotnie wyższy współczynnik przepuszczalności in vitro niż I-S1 (AMSBIO I-S1); jednak różnica ta nie była znacząca po korekcie dla transportu T-Alb. Podsumowując, wyniki te sugerują, że iBEC mogą być bardziej przepuszczalne dla I-S1 niż dla T-Alb, ale różnica jest zbyt mała, aby wspierać badania mechanistyczne za pomocą tego modelu.

dyskusja

Wyniki tego badania pokazują, że I-S1 z dwóch różnych komercyjnych źródeł może z łatwością pokonać mysie BBB, przynajmniej po wstrzyknięciu dożylnym. I-S1 został zarejestrowany ze wszystkich 11 badanych regionów mózgu. Tak rozpowszechnione wejście I-S1 do mózgu może wyjaśniać różne skutki S1 i/lub SARS-CoV-2, takie jak zapalenie mózgu, trudności w oddychaniu i anosmia to białko SARS-CoV-2, które początkowo wiąże się z receptorami na powierzchni komórki i w ten sposób stwarza warunki do internalizacji wirusa. W przypadku transportu przez BBB, białka wiążące wirusa często zachowują się podobnie do samego wirusa.Na przykład interakcje (w tym wiązanie i transport) między glikoproteiną HIV-1 gp120 a BBB są podobne do interakcji wirusa jako całości18, 28. Ponadto wiele, jeśli nie większość, białek wirusowych może same być wysoce aktywne biologicznie; tak samo jest z. B. gp120 wysoce toksyczny. Białka kolczaste koronawirusa są często oddzielane od wirusa przez proteazy w komórce gospodarza. Po rozszczepieniu podjednostki S1 i S2 kolców koronawirusa nie są już kowalencyjnie utrzymywane przez wiązania disiarczkowe, tak że S1 może być wydzielany z wirionów. Możliwe, że podczas infekcji SARS-CoV-2, wydalany S1 jest dostępny do pokonania BBB i wywołania reakcji w samym mózgu, niekoniecznie przechodząc przez nienaruszone cząsteczki wirusa. Dlatego ustalenie, czy S1 przecina BBB, jest ważne dla zrozumienia, czy same SARS-CoV-2 i S1 mogą wywoływać reakcje w mózgu. jeśli nie większość samych białek wirusowych jest wysoce aktywna biologicznie; tak samo jest z. B. gp120 wysoce toksyczny. Białka kolczaste koronawirusa są często oddzielane od wirusa przez proteazy w komórce gospodarza. Po rozszczepieniu podjednostki S1 i S2 kolców koronawirusa nie są już kowalencyjnie utrzymywane przez wiązania disiarczkowe, tak że S1 może być wydzielany z wirionów. Możliwe, że podczas infekcji SARS-CoV-2, wydalany S1 jest dostępny do pokonania BBB i wywołania reakcji w samym mózgu, niekoniecznie przechodząc przez nienaruszone cząsteczki wirusa. Dlatego ustalenie, czy S1 przecina BBB, jest ważne dla zrozumienia, czy same SARS-CoV-2 i S1 mogą wywoływać reakcje w mózgu. jeśli nie większość samych białek wirusowych jest wysoce aktywna biologicznie; tak samo jest z. B. gp120 wysoce toksyczny. Białka kolczaste koronawirusa są często oddzielane od wirusa przez proteazy w komórce gospodarza. Po rozszczepieniu podjednostki S1 i S2 kolców koronawirusa nie są już kowalencyjnie utrzymywane przez wiązania disiarczkowe, tak że S1 może być wydzielany z wirionów. Możliwe, że podczas infekcji SARS-CoV-2, wydalany S1 jest dostępny do pokonania BBB i wywołania reakcji w samym mózgu, niekoniecznie przechodząc przez nienaruszone cząsteczki wirusa. Dlatego ustalenie, czy S1 przecina BBB, jest ważne dla zrozumienia, czy same SARS-CoV-2 i S1 mogą wywoływać reakcje w mózgu. tak samo jest z. B. gp120 wysoce toksyczny. Białka kolczaste koronawirusa są często oddzielane od wirusa przez proteazy w komórce gospodarza. Po rozszczepieniu podjednostki S1 i S2 kolców koronawirusa nie są już kowalencyjnie utrzymywane przez wiązania disiarczkowe, tak że S1 może być wydzielany z wirionów. Możliwe, że podczas infekcji SARS-CoV-2, wydalany S1 jest dostępny do pokonania BBB i wywołania reakcji w samym mózgu, niekoniecznie przechodząc przez nienaruszone cząsteczki wirusa. Dlatego ustalenie, czy S1 przecina BBB, jest ważne dla zrozumienia, czy same SARS-CoV-2 i S1 mogą wywoływać reakcje w mózgu. tak samo jest z. B. gp120 wysoce toksyczny. Białka kolczaste koronawirusa są często oddzielane od wirusa przez proteazy w komórce gospodarza. Po rozszczepieniu podjednostki S1 i S2 kolców koronawirusa nie są już kowalencyjnie utrzymywane przez wiązania disiarczkowe, tak że S1 może być wydzielany z wirionów. Możliwe, że podczas infekcji SARS-CoV-2, wydalany S1 jest dostępny do pokonania BBB i wywołania reakcji w samym mózgu, niekoniecznie przechodząc przez nienaruszone cząsteczki wirusa. Dlatego ustalenie, czy S1 przecina BBB, jest ważne dla zrozumienia, czy same SARS-CoV-2 i S1 mogą wywoływać reakcje w mózgu. Po rozszczepieniu podjednostki S1 i S2 kolców koronawirusa nie są już kowalencyjnie utrzymywane przez wiązania disiarczkowe, dzięki czemu S1 może być wydzielany z wirionów. Możliwe, że podczas infekcji SARS-CoV-2, wydalany S1 jest dostępny do pokonania BBB i wywołania reakcji w samym mózgu, niekoniecznie przechodząc przez nienaruszone cząsteczki wirusa. Dlatego ustalenie, czy S1 przecina BBB, jest ważne dla zrozumienia, czy same SARS-CoV-2 i S1 mogą wywoływać reakcje w mózgu. Po rozszczepieniu podjednostki S1 i S2 kolców koronawirusa nie są już kowalencyjnie utrzymywane przez wiązania disiarczkowe, dzięki czemu S1 może być wydzielany z wirionów. Możliwe, że podczas infekcji SARS-CoV-2, wydalany S1 jest dostępny do pokonania BBB i wywołania reakcji w samym mózgu, niekoniecznie przechodząc przez nienaruszone cząsteczki wirusa. Dlatego ustalenie, czy S1 przecina BBB, jest ważne dla zrozumienia, czy same SARS-CoV-2 i S1 mogą wywoływać reakcje w mózgu. że podczas infekcji SARS-CoV-2 wydalany S1 jest dostępny do pokonania BBB i wywołania reakcji w samym mózgu, niekoniecznie przechodząc przez nienaruszone cząsteczki wirusa. Dlatego ustalenie, czy S1 przecina BBB, jest ważne dla zrozumienia, czy same SARS-CoV-2 i S1 mogą wywoływać reakcje w mózgu. że podczas infekcji SARS-CoV-2 wydalany S1 jest dostępny do pokonania BBB i wywołania reakcji w samym mózgu, niekoniecznie przechodząc przez nienaruszone cząsteczki wirusa. Dlatego ustalenie, czy S1 przecina BBB, jest ważne dla zrozumienia, czy same SARS-CoV-2 i S1 mogą wywoływać reakcje w mózgu.

Nasza metoda badania farmakokinetyki S1 ma wiele zalet w porównaniu z bardziej tradycyjnym podejściem do określania pobierania i dystrybucji wirusa, które opiera się na odzyskiwaniu wirusa. Radioznakowanie umożliwia wykrycie S1 w bardzo niskich stężeniach oraz ilościowe określenie szybkości wychwytu przez mózg i inne tkanki. Czynniki, które mogą wpływać na wychwyt białka wirusowego, można eksperymentalnie manipulować u zdrowych i niezakażonych zwierząt. Wychwyt zwrotny I-S1 z tkanki odzwierciedla tylko czynniki związane z przepuszczalnością, podczas gdy wychwyt zwrotny z zakażonych myszy odzwierciedla również inne czynniki, takie jak: B. tempo replikacji wirusa w tej tkance.

Kluczowym pytaniem, na które częściowo odpowiedzieliśmy, było: jakiego receptora używa I-S1 do penetracji mózgu i innych tkanek? Na podstawie doświadczenia z SARS zakłada się, że SARS-CoV-2 wiąże się z ludzkim ACE2, ale nie z mysim ACE2. SARS może infekować myszy typu dzikiego (WT), ale nie powoduje poważnych objawów i śmierci, z wyjątkiem myszy transgenicznych, które nadeksprymują ludzkie ACE2, chociaż może to być również po prostu dlatego, że te transgeniczne myszy eksprymują 8-12 razy więcej ACE2 niż myszy WT. Myszy użyte tutaj eksprymowały tylko mysie receptory, więc nasze wyniki sugerują, że założenie, że ACE2 musi być ludzkim białkiem, jest błędne i pokazują, że można użyć myszy WT w badaniach kinetycznych S1, a prawdopodobnie także SARS-CoV-2.

Znaleźliśmy dość mocne dowody na to, że mysie ACE2 jest zaangażowane w wychwyt I-S1 w tkance płucnej, ponieważ jednoczesne wstrzykiwanie I-S1 z rozpuszczalnymi substratami ACE2 i ACE2 zwiększyło wychwyt I-S1 (to być może zaskakująca obserwacja będzie dalej omawiana poniżej). Dowody na udział ACE2 w wychwytywaniu I-S1 w mózgu są słabsze niż w przypadku płuc, ponieważ tutaj na wychwyt wpływało jednoczesne wstrzyknięcie rozpuszczalnego ACE2, ale nie substratów ACE2. Odkrycie, że rozpuszczalne substraty ACE2 lub ACE2 nie miały wpływu na wychwyt I-S1 przez nerki, wątrobę i śledzionę, sugeruje, że receptory inne niż lub oprócz ACE2 biorą udział w wychwytywaniu I-S1 w niektórych zaangażowanych tkankach.

To, że S1, a nawet SARS-CoV-2, wykorzystywałyby więcej niż jeden receptor, nie jest zaskakujące, biorąc pod uwagę, że wiele wirusów wykorzystuje wiele receptorów. Na przykład, HIV-1 wykorzystuje receptory CD4 i fosforanu mannozy-6, a wirus wścieklizny wykorzystuje receptor acetylocholiny, receptor czynnika wzrostu nerwów i cząsteczkę adhezyjną komórek nerwowych do wchodzenia do komórek. Receptory (oprócz ACE2), które mogą wiązać SARS-CoV-2 lub przewidywane na podstawie modelowania, aby wiązać SARS-CoV-2, obejmują bazyginę, cyklofilinę, peptydazę dipeptydylową-4 i GRP78.

Jednym z powodów, dla których wirus może wykorzystywać tak różnorodne receptory, jest to, że wirusy wiążą się mniej specyficznie niż endogenne ligandy receptorów. Miejscami wiązania dla białek wirusowych są często regiony o wysokim ładunku na glikoproteinie błony komórkowej ze względu na wysokie stężenia kwasu sialowego, N-acetyloglukozaminy lub siarczanu heparanu. Koronawirusy zazwyczaj wiążą się z glikoproteinami o wysokiej zawartości kwasu sialowego. Pionierskie prace wykazały, że wiązanie WGA z regionami BBB bogatymi w kwas sialowy lub N-acetyloglukozaminę prowadzi do transportu WGA przez BBB poprzez mechanizm transcytozy adsorpcyjnej. WGA podawany razem ze słabszym induktorem adsorpcyjnym transcytozy często zwiększa penetrację BBB przez słabszy induktor, zamiast go blokować.

Ponieważ białko wypustek SARS-CoV-2 jest bardziej naładowane niż białko wypustek SARS, zasugerowano, że może wiązać się z większą liczbą receptorów. Niektóre wirusy wiążą receptory bogate w siarczan heparanu; wychwyt tych wirusów jest hamowany przez heparynę. Byliśmy w stanie wykazać, że heparyna hamowała wychwyt I-S1 w wątrobie, ale nie wychwyt w mózgu i innych tkankach obwodowych. Wyniki te pokazują, że S1 wykorzystuje siarczan heparanu do wiązania się z wątrobą, ale nie z innymi tkankami. Dochodzimy do wniosku, że wiele receptorów jest prawdopodobnie zaangażowanych w wychwyt S1; który receptor jest najważniejszy, różni się w zależności od tkanki. Ważna będzie identyfikacja związanych z błoną glikoprotein, które działają jako receptory dla SARS-CoV-2.

Nie jest jasne, dlaczego w naszym badaniu jednoczesne wstrzykiwanie substratów ACE2 lub ACE2 raczej wzmagało niż hamowało wychwyt dożylnie wstrzykiwanego I-S1, ale istnieje kilka możliwych wyjaśnień. Ponieważ S1 nie wiąże się z miejscem katalitycznym ACE2, może nie wystąpić tradycyjna kinetyka hamowania ligand-receptor zależna od dawki. ACE2, które wstrzyknęliśmy wspólnie z I-S1 może mieć związane krążące Ang II, które normalnie współzawodniczyłyby z I-S1 o wiązanie z ACE związanym z błoną. Ponadto S1 jest związany z SARS-CoV-2 jako homotrimer, ale zbadaliśmy monomeryczny S1; możliwe jest, że wspólne wstrzyknięcie ligandów ACE2 zmieniło konformację ACE2, aby ułatwić wiązanie monomeru S1.

Czynniki ryzyka zarówno rozwoju COVID-19, jak i złego wyniku leczenia obejmują mężczyzn, którzy są dodatni pod względem allelu ApoE4 w porównaniu z allelem ApoE3, podczas gdy burza cytokin jest cechą poważnej choroby. Odkryliśmy, że wpływ płci, genotypu ApoE i stanu zapalnego na wychwyt I-S1 w różnych tkankach jest różny. Płeć i status ApoE myszy nie miały wpływu na wychwyt dożylnie podanego I-S1 w całym mózgu lub w płucach, ale na wychwyt w opuszce węchowej, wątrobie, śledzionie i nerkach, dzięki czemu absorpcja w Male była wyższa. Oznacza to ta część ryzyka złego wyniku u mężczyzn może być związana z poziomem zwiększonego wychwytu S1 lub SARS-CoV-2 w ich tkankach. Jednak ApoE3, a nie ApoE4, wiązało się z wyższymi wskaźnikami wychwytu I-S1 przez opuszkę węchową, wątrobę, śledzionę i nerki, co sugeruje, że ryzyko związane ze statusem ApoE prawdopodobnie nie jest spowodowane wzrostem S1 lub SARS -CoV -2 wychwyt tkanek.

Zapalenie wywołane przez wstrzyknięcie LPS zwiększyło ilość wstrzykiwanego dożylnie I-S1, który dostał się do mózgu, ale wzrost ten był prawdopodobnie spowodowany zaburzeniem BBB, a nie wzrostem transcytozy adsorpcyjnej; w rzeczywistości wychwyt I-S1 po skorygowaniu przerwania BBB w jednym obszarze mózgu, opuszce węchowej, był niższy. Myszy eksponowane na LPS miały wyższy wychwyt I-S1 w płucach, ale niższy w śledzionie i wątrobie; to ostatnie prawdopodobnie wyjaśnia, dlaczego te myszy miały obniżony klirens I-S1 z krwi. Warto zauważyć, że ten spadek klirensu z krwi obserwowany u myszy w stanie zapalnym sugeruje, że wszystkie tkanki są narażone na wyższe stężenia S1 niż w stanie niezapalnym.

Infekcja śmiertelna może wystąpić po donosowym podaniu SARS. Postuluje się, że wirus nosowy rozprzestrzenia się do płuc, a stamtąd do krwi i mózgu, ale inni sugerują, że SARS-CoV-2 może rozprzestrzeniać się do mózgu w przewodach nosowych przez nerw węchowy, podobnie jak wiele innych wirusów zrobić. Chociaż nasze wyniki pokazują, że podawany donosowo I-S1 może penetrować tkankę mózgową myszy, podkreślają one BBB jako główną drogę wejścia I-S1 do mózgu. Ponadto we krwi stwierdzono bardzo małą ilość (0,66% biodostępność po podaniu donosowym) I-S1, co sugeruje niski transfer z nosa do krwi. Jednak nasze badania miały na celu ocenę zdolności I-S1 do: do mózgu przez nerw węchowy, a nie do krwi przez układ naczyniowy nosa. Niemniej jednak nasze wyniki sugerują, że obszary inne niż przewody nosowe, takie jak B. płuca, punkt wejścia S1 wykrytego we krwi.

Należy zauważyć, że chociaż badanie pokazuje, że I-S1 krzyżuje się z BBB u myszy, może tego nie robić u ludzi. Z tego powodu wykorzystaliśmy modele ludzkiego BBB in vitro, które mogą być przydatne w badaniu mechanizmów przepuszczalności BBB. Model zastosowany w tym badaniu pochodzi z ludzkich iPSC i rozwija fenotyp podobny do komórek śródbłonka mózgu, który obejmuje funkcjonalne transportery napływu i odpływu BBB oraz silne właściwości barierowe, które umożliwiają badanie transportu bez zakłócających skutków wysokiego poziomu przecieku wyjściowego. W tym modelu nie mogliśmy zaobserwować żadnych istotnych różnic w przepuszczalności dla I-S1 w porównaniu z T-Alb. Widoczny brak transportu I-S1 przez BBB w tym modelu in vitro może być spowodowany problemami technicznymi, takimi jak: B. na blokerach wiązania I-S1 w buforach. Może to również oznaczać, że iBEC nie wyrażają glikoprotein błony komórkowej niezbędnych do transportu I-S1 lub że I-S1 nie może przejść przez ludzki BBB. Wskazówką na słuszność zastosowania monomerycznego S1 jako modelu dla SARS-CoV-2 jest to, że S1 jest zwykle związany z SARS-CoV-2 jako trimer. Jednak białko S1 może być wydalane z wirusa in vivo, a zatem samo badanie monomerów S1 może być ważne – chociaż obecnie nie ma bezpośrednich dowodów na to, że białka kolczaste są wydalane przez SARS-CoV-2. Ogólnie rzecz biorąc, nasze wyniki zdecydowanie sugerują

Metody

Myszy

Wszystkie badania na myszach zostały zatwierdzone przez lokalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Oregon Health & Sciences University oraz Veterans Affairs Puget Sound Health Care System (VAPSHCS) i zostały przeprowadzone w obiektach zatwierdzonych przez Amerykańskie Stowarzyszenie Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC). są. Samce myszy CD-1 (6-10 tygodni) zakupiono z Charles River Laboratories (Hollister). We wszystkich badaniach wykorzystano łącznie 204 mężczyzn CD-1. Samce i samice myszy celowanej wymiany (TR) E3 i E4 wytworzone jak opisano wcześniej hodowano w Oregon Health & Sciences University przed przeniesieniem do VAPSHCS do eksperymentów. Myszy TR E3 i E4 miały około 4 miesięcy w dniu badania. We wszystkich badaniach wykorzystano łącznie 21 myszy E3 i 20 E4 TR. Myszy miały dostęp ad libitum do pożywienia i wody i trzymano je w 12/12 godzinnym cyklu światło-ciemność. Utrzymywano temperaturę 18-23°C, a wilgotność 40-60%. We wszystkich doświadczeniach myszy znieczulano za pomocą dootrzewnowej iniekcji 0,15-0,2 ml 40% uretanu w celu zminimalizowania bólu i stresu. Znieczulone myszy umieszczano na poduszce grzewczej do czasu podania. Pod koniec każdego badania myszy poddawano eutanazji przez dekapitację w znieczuleniu. We wszystkich doświadczeniach myszy znieczulano za pomocą dootrzewnowej iniekcji 0,15-0,2 ml 40% uretanu w celu zminimalizowania bólu i stresu. Znieczulone myszy umieszczano na poduszce grzewczej do czasu podania. Pod koniec każdego badania myszy poddawano eutanazji przez dekapitację w znieczuleniu. We wszystkich doświadczeniach myszy znieczulano za pomocą dootrzewnowej iniekcji 0,15-0,2 ml 40% uretanu w celu zminimalizowania bólu i stresu. Znieczulone myszy umieszczano na poduszce grzewczej do czasu podania. Pod koniec każdego badania myszy poddawano eutanazji przez dekapitację w znieczuleniu.

Źródła i radioaktywne znakowanie białek

Białka S1 zostały dostarczone przez producentów (RayBiotech, 230-30161, Val 16-Gln 690; AMSBIO, AMS.S1N-C52H3, Val 16-Arg 685). Białka rozpuszczono w PBS (pH 7,4) w stężeniu 0,45-0,61 mg ml-1. Białka wytworzono w liniach komórkowych HEK293, miały C-końcowe znaczniki His, obliczono, że miały wielkość około 76 kDa, ale migrowały z 100-120 kDa na żelu z powodu glikozylacji. Po otrzymaniu białka S1 rozmrożono i podzielono na porcje po 5 µg i albo użyto natychmiast, albo przechowywano w -80°C do czasu użycia. 5 µg rozmrożonego białka S1 znakowano radioaktywnie 1 mCi 125I (Perkin Elmer) stosując metodę chloraminy-T, jak opisano wcześniej. I-S1 oczyszczono na kolumnie G-10 Sephadex (GE Healthcare) i eluowano PBS w szklanych probówkach, zawierający 1% BSA w roztworze Ringera z dodatkiem mleczanu (BSA-LR). Na podstawie ilości jodowanego białka oszacowaliśmy, że aktywność właściwa I-S1 wynosiła około 11 Ci g-1, czyli około 12,5 ng na 300 000 cpm. BSA (Sigma) znakowano 99mTc (GE Healthcare) metodą winianu cyny. T-Alb oczyszczono na kolumnie G-10 Sephadex. Zarówno I-S1, jak i T-Alb były w ponad 90% filtrowalne przez kwas. Masę cząsteczkową znakowanych białek określono wykonując 200 000-600 000 cpm w buforze 1 × LDS (Invitrogen) z lub bez środka redukującego (Invitrogen) na 4-12% żelu Bis-Tris (GenScript) w buforze MOPS (Invitrogen ) Potwierdzony. Żel utrwalano następnie przez 30 min w 10% kwasie octowym / 50% metanolu, Przemyte 3 razy wodą, a następnie wysuszone za pomocą DryEase Mini-Gel Drying System (Invitrogen). Wysuszone żele eksponowano na kliszę autoradiograficzną przez 24 godziny, a następnie wywołano. Główne pasma I-S1 opracowane przez RayBiotech i AMSBIO migrowały zgodnie z przewidywanymi wzorcami masy cząsteczkowej na podstawie instrukcji producenta.

hinzuu.com

6.00 avg. rating (99% score) - 1 vote
CZERWONE

Wyraź swoją opinię ! TO WAŻNE !!

Witryna wykorzystuje Akismet, aby ograniczyć spam. Dowiedz się więcej jak przetwarzane są dane komentarzy.

ODBLOKUJ TREŚCI I STREAM KLIKAJĄC W PONIŻSZY OBRAZEK PEŁNA INSTRUKCJA  + MATERIAŁ FILMOWY !! 

Holler Box

KORZYSTASZ Z OGRANICZONEGO CZASOWO DOSTĘPU !!

DALSZE KORZYSTANIE ZE STRONY MOŻLIWE PO URUCHOMIENIU DOSTĘPU PREMIUM 

 

STREAM PONIEDZIAŁEK , WTOREK, ŚRODA , CZWARTEK 21.00 - SOBOTA 20.00

ABY TA BLOKADA STRONY BYŁA DLA CIEBIE NIE WIDOCZNA ZAŁÓŻ KONTO I ZALOGUJ SIĘ INSTR. FILMOWA PONIŻEJ :-)

ODBLOKUJ TREŚCI I STREAM KLIKAJĄC W PONIŻSZY OBRAZEK PEŁNA INSTRUKCJA  + MATERIAŁ FILMOWY !! 

Holler Box
%d bloggers like this: