NAJCZĘŚCIEJ CZYTANE
Lekarz przerywa milczenie: poważne skutki uboczne, dzieci i osoby starsze zagrożone
RAPORT COVIDOWY - TRAGEDIA NARODU POLSKIEGO - Paweł Klimczewski  ekspert analizy danych spolecznych i demograficznych, PSNLiN
Rządowa agencja zwołuje pilne spotkanie. Setki przypadków zapalenia mięśnia sercowego u młodych ludzi po przyjęciu szczepionek Moderny i Pfizera
Ewelina Gierszewska  lek. med. PSNLiN EKSPERYMENTALNY PREPARAT ZWANY SZCZEPIONKĄ PRZECIW COVIDOWĄ
   POLITYKA STRONY M-FORUM !!! - WSZYSTKIE ZAMIESZCZANE MATERIAŁY ORAZ PREZENTOWANE I PROPAGOWANE - Poglądy i opinie zawarte w artykułach mogą być niezgodne ze stanowiskiem redakcji. !!!! REDAKCJA M-FORUM AV LIVE MA NA CELU PUBLIKOWANIE WSZYSTKICH INFORMACJI KTÓRE SĄ CENZUROWANE BEZ WZGLĘDU NA ZABARWIENIA POLITYCZNE , RELIGIJNE I OBYCZAJOWE - ZA KOMENTARZE I WYPOWIEDZI CZYTELNIKÓW I WIDZÓW NIE BIERZE ODPOWIEDZIALNOŚCI , Z WYJĄTKIEM TREŚCI O CHARAKTERZE PRZESTĘPCZYM KTÓRE BĘDĄ USUWANE BEZ OSTRZEŻEŃ     UWAGA !! WAŻNE - Poglądy i opinie zawarte w artykule mogą być niezgodne ze stanowiskiem redakcji. Zamieszczane artykułu są w wiekszości re- publikacjami materiałów z innych stron - REDAKCJA NIE INGERUJE W ICH TREŚCI W CELU ZACHOWANIA BEZSTRONNOŚCI , A CELEM PUBLIKACJI JEST PODDANIE TYCH MATERIAŁÓW POD OSĄD I KRYTYKĘ CZYTELNIKÓW W KTÓRE OPINIE NIE MOŻE INGEROWAĆ AUTOR MATERIAŁU W FORMIE MODERACJI LUB CENZURY

M-forum A.V Live.

TO PORTAL NA KTÓRYM CODZIENNIE ZNAJDZIESZ PONAD 100 INFORMACJI INFO NIUS W TYM MATERIAŁY CENZUROWANE LUB ZABRONIONE NA INNYCH PORTALACH POPRAWNYCH POOLITYCZNIE

CZERWONE

Dkt. RUBAS Badania !! Przeciwdziałanie kolcom IgG powoduje ciężkie uszkodzenie płuc!!

The following two tabs change content below.

Gabi

Witam, nazywam się Gabriela Nowak, pracuję jako asystentka  zarządzania i obsługi Klienta w Kancelarii Prawnej,  niedawno w kwietniu 2019 r zostałam Przewodnicząca Komisji Skrutacyjnej w Radzie Miasta - gdzie czynnie reprezentuję interesy mieszkańców, którzy mi zaufali i mnie wybrali ! STOP CENZURZE   UWAŻASZ, ŻE CENZURA - ŁAMIE TWOJE PRAWA RP ?  WESPRZYJ MNIE - W TYM CO ROBIĘ - ♛  z dopiskiem - DAROWIZNA  ! Nest Bank Polska 75187010452078115029220001  Nest Bank zagranica IBAN PL75187010452078115029220001  Kod SWIFT Nest Bank: NESBPLPW   Dziękuję, $$$ Pozdrawiam i zapraszam do komentowania !   ♡♡♡ ZOBACZ TAKŻE POMAGAM ♡♡♡  https://zrzutka.pl/gc97mb
Dkt RUBAS Eksperyment na dzieciach!
Badanie firmy Pfizer: u 79% zaszczepionych dzieci w wieku powyżej 12 lat wystąpiły działania niepożądane
https://report24.news/pfizer-studie-79-geimpfter-kinder-ueber-12-jahre-entwickelten-nebenwirkungen/?fbclid=IwAR0l4prnfVPBjYRZ_RqjWm5GIGNXTMkl4S77YF2MCND_NShmqDWUpj-2hh8

Wysoki poziom przeciwciał nie zawsze powinien być powodem do zadowolenia – eksperyment pod kątem wpływu przeciwciał IgG p/ko białku S na uszkodzenie tkanki płucnej w przebiegu infekcji SARS1

Omawiany w video material poniżej w linkach

Przeciwdziałanie kolcom IgG powoduje ciężkie ostre uszkodzenie płuc poprzez wypaczenie odpowiedzi makrofagów podczas ostrej infekcji SARS-CoV

Li Liu, 1,2 Qiang Wei, 3 Qingqing Lin, 1 Jun Fang, 1 Haibo Wang, 1 Hauyee Kwok, 1 Hangying Tang, 1 Kenji Nishiura, 1 Jie Peng, 1 Zhiwu Tan, 1 Tongjin Wu, 1 Ka-Wai Cheung , 1 Kwok-Hung Chan, 1 Xavier Alvarez, 4 Chuan Qin, 3 Andrew Lackner, 4 Stanley Perlman, 5,6 Kwok-Yung Yuen, 1 i Zhiwei Chen 1,2

Opublikowano 21 lutego 2019 r. – Więcej informacji

Zobacz PDF 

Nowo pojawiające się wirusy, takie jak koronawirus ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV), bliskowschodni zespół oddechowy CoV (MERS-CoV) i H7N9, powodują śmiertelne ostre uszkodzenie płuc (ALI) poprzez napędzanie hipercytokinemii i agresywnego stanu zapalnego poprzez mechanizmy, które pozostają nieuchwytne . W modelach SARS-CoV/macaque ustaliliśmy, że przeciwciała IgG przeciwko kolcom (S-IgG) w płucach zakażonych produktywnie powodują ciężkie ALI poprzez wypaczanie odpowiedzi na zapalenie. Makrofagi pęcherzykowe uległy polaryzacji funkcjonalnej u makaków o ostrym zakażeniu, wykazując jednocześnie właściwości prozapalne i gojenia się ran. Jednak obecność S-IgG przed usunięciem wirusa znosiła reakcje gojenia ran i sprzyjała wytwarzaniu MCP1 i IL-8 oraz prozapalnej rekrutacji i akumulacji monocytów/makrofagów. Krytycznie pacjenci, którzy ostatecznie zmarli z powodu SARS (dalej określani jako pacjenci zmarły), wykazywali podobnie nagromadzoną prozapalną pracę płuc, brak gojących się ran makrofagów i szybszą odpowiedź przeciwciał neutralizujących. Ich surowice wzmagały indukowane SARS-CoV wytwarzanie MCP1 i IL-8 przez ludzkie makrofagi gojące rany pochodzące z monocytów, podczas gdy blokada FcγR zmniejszała takie efekty. Nasze odkrycia ujawniają mechanizm odpowiedzialny za ALI za pośrednictwem wirusa, definiują patologiczną konsekwencję odpowiedzi przeciwciał swoistych dla wirusa i stanowią potencjalny cel leczenia SARS-CoV lub innego uszkodzenia płuc za pośrednictwem wirusa. Ich surowice wzmagały indukowane SARS-CoV wytwarzanie MCP1 i IL-8 przez ludzkie makrofagi gojące rany pochodzące z monocytów, podczas gdy blokada FcγR zmniejszała takie efekty. Nasze odkrycia ujawniają mechanizm odpowiedzialny za ALI za pośrednictwem wirusa, definiują patologiczną konsekwencję odpowiedzi przeciwciał swoistych dla wirusa i stanowią potencjalny cel leczenia SARS-CoV lub innego uszkodzenia płuc za pośrednictwem wirusa. Ich surowice wzmagały indukowane SARS-CoV wytwarzanie MCP1 i IL-8 przez ludzkie makrofagi gojące rany pochodzące z monocytów, podczas gdy blokada FcγR zmniejszała takie efekty. Nasze odkrycia ujawniają mechanizm odpowiedzialny za ALI za pośrednictwem wirusa, definiują patologiczną konsekwencję odpowiedzi przeciwciał swoistych dla wirusa i stanowią potencjalny cel leczenia SARS-CoV lub innego uszkodzenia płuc za pośrednictwem wirusa.

Wprowadzenie

Koronawirus ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV) powoduje śmiertelną chorobę układu oddechowego u ludzi ( 1 –3 ). Pacjenci z SARS (dalej określani jako pacjenci SARS) wykazywali cechy ostrego uszkodzenia płuc (ALI), w tym rozlane uszkodzenie pęcherzyków płucnych (DAD), martwicę nabłonka oraz odkładanie się fibryny i szklistości (4 ,5 ). U większości pacjentów, którzy umierają na SARS, rozwija się zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), najcięższa postać ALI (6 ,7 ). Niedawne ogniska ciężkich ostrych infekcji dróg oddechowych pojawiających się wirusów, w tym bliskowschodniego zespołu oddechowego CoV (MERS-CoV), wysoce patogennych wirusów ptasiej grypy (np. H5N1 i H7N9), podkreślają potrzebę scharakteryzowania mechanizmów odpowiedzialnych za ALI lub ARDS.

Podstawą ARDS jest ostry początek zapalenia płuc, który jest ściśle związany z polaryzacją i funkcją monocytów/makrofagów ( 7 ,8). Makrofagi płucne są wysoce plastycznymi i heterogenicznymi komórkami, które rezydują w śródmiąższu i pęcherzykach płucnych lub są rekrutowane przez bodźce zapalne. Zapalne monocyty i rezydentne makrofagi tkankowe odgrywają kluczową rolę w inicjowaniu i utrzymywaniu stanu zapalnego w ostrej fazie ARDS, a także w fagach restrukturyzacyjnych i rekonwalescencji z ARDS. W stanie ustalonym, rezydentne makrofagi są zwykle w stanie spoczynku, aby zapobiec uszkodzeniu pęcherzyków i są krytycznie zaangażowane w normalną homeostazę tkanek. Po uszkodzeniu tkanki lub podczas infekcji aktywują się rezydentne makrofagi. Krążące monocyty mogą być skutecznie rekrutowane do miejsca urazu. Zapalne monocyty/makrofagi (IMM) i rezydentne makrofagi ulegają wyraźnym zmianom fenotypowym i funkcjonalnym,9). Podczas ostrej infekcji monocyty/makrofagi często wykazują fenotyp klasycznie aktywowanych makrofagów. Komórki te pośredniczą w obronie gospodarza przed wirusami, a także promują uszkodzenie płuc poprzez wytwarzanie tlenku azotu (NO); ROS; IL-1, IL-6 i IL-8; i TNF. Jednocześnie, niektóre makrofagi mogą być alternatywnie aktywowane, wywierając działanie przeciwzapalne i regulujące gojenie ran poprzez wytwarzanie metaloproteinaz macierzy (MMP), czynników wzrostu i cytokin przeciwzapalnych, zwłaszcza TGF-β. Kiedy patogen lub bodziec zapalny zostaje wyeliminowany, makrofagi prozapalne zmniejszają się. Dominująca populacja makrofagów przyjmuje fenotyp gojenia się ran. W końcowej fazie regeneracji makrofagi wykazują fenotyp regulatorowy/supresyjny, wydzielając zwiększone poziomy IL‑10, co ułatwia rozwiązanie gojenia się ran i przywraca homeostazę. Kiedy odpowiedź gojenia się rany jest dobrze zorganizowana i kontrolowana, odpowiedź zapalna szybko ustępuje i przywracana jest normalna architektura tkanki. Zaburzenia w gojeniu się ran mogą prowadzić do niekontrolowanego wytwarzania mediatorów stanu zapalnego, przyczyniając się do stanu trwałego uszkodzenia (9 –11 ). U pacjentów, którzy ostatecznie zmarli z powodu SARS (zwanych dalej pacjentami zmarłymi) i modelach zwierzęcych, rozległe uszkodzenie płuc jest związane z wysokim początkowym mianem wirusa, zwiększoną akumulacją IMM w płucach i podwyższonym poziomem cytokin prozapalnych w surowicy (IL-1, IL-6). , IL-8, CXCL-10 i MCP1) (4 ,5 ,12 ,13 ). Chociaż wiele wiadomo na temat terminalnej fazy SARS, niewiele wiadomo na temat wczesnych zdarzeń immunologicznych podczas ostrej fazy infekcji. Badania określające heterogeniczność i funkcję makrofagów podczas ostrej infekcji i ALI z wykorzystaniem próbek naczelnych i pacjentów innych niż człowiek są ograniczone, a czynniki wywołujące hipercytokinemię i agresywne zapalenie pozostają nieuchwytne.

Podczas wybuchu SARS w Hongkongu większość pacjentów (70–80%) miała nieprawidłowe radiogramy klatki piersiowej, a około jedna czwarta tych osób rozwijała się w ALI. Po 12 dniach u 80% tych pacjentów z SARS rozwinął się ARDS, zbiegający się z serokonwersją IgG ( 6 ). W szczegółowej analizie odpowiedzi przeciwciał na glikoproteinę SARS-CoV spike (S) pisaliśmy, że odpowiedź przeciwciał neutralizujących anty-S (NAb) rozwijała się znacznie szybciej u pacjentów zmarłych w porównaniu z pacjentami wyzdrowiałymi po wystąpieniu objawów klinicznych (14 ). Osiągnięcie szczytu aktywności NAb zajęło pacjentom po wyzdrowieniu średnio 20 dni, w przeciwieństwie do zaledwie 14,7 dni w przypadku pacjentów zmarłych. Co więcej, rzeczywiste miano NAb jest znacznie wyższe u pacjentów zmarłych w porównaniu z tym u pacjentów, którzy wyzdrowieli w tym samym okresie czasu (14 ). Wyniki te sugerują rolę przeciwciał anty-S w ALI, w którym pośredniczy SARS-CoV podczas ostrej infekcji. Konsekwentnie stwierdzono, że istniejące wcześniej przeciwciała w surowicy przeciwko antygenom grypy wiązały się z gorszym nasileniem klinicznym i złymi wynikami u pacjentów podczas pandemii grypy w 2009 roku (15 ,16 ). Co więcej, wiele platform szczepionek i infekcja wirusowa wydawały się indukować pamięć immunologiczną specyficzną dla SARS-CoV, która nasilała zapalenie płuc po homologicznej prowokacji u myszy i afrykańskich małp zielonych (17 –19 ). Mechanizm odpowiedzialny za reakcję immunopatologiczną pozostaje niejasny. Ostatnie badania sugerują, że limfocyty T odgrywają kluczową rolę w ochronie myszy przed śmiertelną infekcją SARS-CoV (20 –22 ). Wzmocniona immunopatologia płuc u zwierząt zaszczepionych i poddanych prowokacji odzwierciedla niewystarczającą odpowiedź Th1 (22 ,23 ). Rola odpowiedzi przeciwciał swoistych dla wirusa w uszkodzeniu płuc wywołanym przez SARS-CoV nie została jeszcze jasno określona. Dlatego zastosowaliśmy strategie szczepień i biernej immunizacji anty-S-IgG, aby ocenić wpływ przeciwciał anty-S na wywołane SARS-CoV ALI u chińskich małp rezus ( Macaca mulatta ). Nasze wyniki pokazują teraz, że w produktywnie zakażonych płucach anty-S-IgG powoduje ciężkie ALI poprzez wypaczanie odpowiedzi zapalnych podczas ostrej infekcji.

Wyniki

Odporność S-specyficzna wywołana przez szczepionkę skutkowała ciężkim ALI u makaków chińskich zakażonych SARS-CoV. Początkowo porównaliśmy zmiany patologiczne w płucach makaków rezus zaszczepionych zmodyfikowanym wirusem krowianki Ankara (MVA) kodującym pełnej długości glikoproteinę SARS-CoV S (ADS-MVA) lub kontrolę w 7 i 35 dniu po patogennym SARS-CoV PUMC ( 1 x 10 5 do hodowli tkankowych dawka zakaźna 50% [TCID 50 ]), testu ( 24 ). Trzy zdrowe makaki włączono jako kontrole. Szesnaście makaków immunizowano dwukrotnie: 8 zwierząt ADS-MVA i kolejne 8 zwierząt kontrolnym MVA (ADC-MVA) ( Figura 1A ) (24 ). Szczepienie ADS-MVA indukowało wysoki poziom anty-SARS-CoV NABS wszystkich 8 makaków z surowicy IC 50 wartości od 10,232- do 28703-krotnych rozcieńczeń ( Figura 1B ). Żaden z makaków nie rozwinął gorączki podczas lub po szczepieniu (normalna temperatura ciała 37,8°C–38,1°C). IC 50 Wartości te surowice były zachowane, z ponad 2000-krotnie odwrotności rozcieńczenia surowicy w 4 tygodnie po immunizacji wtórnej, do czasu, gdy wszystkie zwierzęta były wątpliwości ( Figury 1B). Po prowokacji wirusowej u wszystkich makaków rozwinęła się gorączka między 1 a 5 dniem po zaszczepieniu (dpi) w zakresie od 38,6°C do 39,2°C, a surowice z makaków szczepionych w grupie kontrolnej wykazywały zwiększoną aktywność neutralizującą po 14 dpi, co wskazuje na powstanie infekcji ( Figura 1B ). . SARS-CoV RNA było łatwo wykrywane na wymazach z jamy ustnej ze wszystkich kontrolnych makaków badanych w wielu punktach czasowych przy użyciu PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (RT-PCR w czasie rzeczywistym), ale tylko u 3 z 8 makaków zaszczepionych ADS-MVA z niższym NAb miana w 2 dpi (SL11, SE13 i SL14) ( Figura 1C ), co sugeruje zmniejszenie produktywnej infekcji wirusowej u immunizowanych makaków poprzez odporność swoistą dla S.

Swoista odpowiedź immunologiczna indukowana przez ADS-MVA wzmocniona patologia płuc u pacjentów z

Rysunek 1Swoista odpowiedź immunologiczna wywołana przez ADS-MVA wzmocniła patologię płuc u chińskich makaków rezusów zakażonych SARS-CoV. A ) Projekt eksperymentalny wykorzystany do zbadania wpływu odporności swoistej dla S na uszkodzenie płuc wywołane przez SARS-CoV. Dwie grupy chińskich makaków rezus ( n = 8 / grupę) poddano im zastrzyków ADS-MVA lub szczepionek kontrola ADC MVA w tygodniu 0 i 4, a następnie w prowokacji żywych patogennych SARS CoV PUMC (1 x 10 5 TCID 50 ) w 4 tygodnie po drugim szczepieniu. Każde z czterech zwierząt uśmiercono w 1 i 5 tygodniu po zaszczepieniu. Trzy zdrowe makaki włączono jako kontrole. ( B) Działanie neutralizujące serum. Surowice zebrane z makaków przetestowano pod kątem zdolności do neutralizacji pseudotypu wirusa SARS-CoV. ( C ) Wykrywanie wirusowego RNA w wymazach z jamy ustnej. SARS-CoV RNA wykryto za pomocą zagnieżdżonej RT-PCR w wymazach we wskazanych punktach czasowych w stosunku do infekcji. ( D ) Zmiany patologiczne tkanki płucnej. Skrawki wybarwiono H&E. repokazuje objawy ostrego DAD wykazującego u 6 z 8 makaków zaszczepionych ADS-MVA z rozległym wysiękiem (żółta strzałka), błonami szklistymi wyścielającymi ściany pęcherzyków (czarne strzałki) i masywnym naciekiem komórkowym w jamach pęcherzyków (biała strzałka). Lewy obraz przedstawia przegląd w małym powiększeniu (100×). Środkowy obraz przedstawia większe powiększenie obramowanego obszaru na lewym obrazie (200×). Prawy obraz przedstawia niewielkie zapalenie obserwowane u 7 makaków, które otrzymały ADC-MVA ( n = 8) z niewielkim poszerzeniem przegród pęcherzykowych i rzadkim naciekiem monocytów (pierwotne powiększenie 100x). ( E ) Wyniki histopatologiczne grupy ADS-MVA, w tym próbki płuc zebrane zarówno w 7, jak i 35 dpi, porównano z grupą kontrolną ADC-MVA. Patrz rysunek uzupełniający 1dla wskaźnika punktacji opartego na ciężkości histopatologii płuc. Dane przedstawiają średnie ± wartości SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu dwustronnego niesparowanego testu t- Studenta. * P < 0,05, n = 4. ( F ) Korelacja wyników histopatologicznych płuc wszystkich makaków z mianami surowic NAb w 0 dpi. Linie ciągłe oznaczają związek między wynikami histopatologicznymi a aktywnością neutralizującą surowicę. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu korelacji rang Spearmana.

Jednak badanie histologiczne ujawniło ostry DAD o różnym stopniu nasilenia u 6 makaków zaszczepionych ADS-MVA w 7 i 35 dpi, podczas gdy większość makaków kontrolnych w grupie ADC-MVA wykazywała zapalenie od niewielkiego do umiarkowanego ( Figura 1D ). Aby lepiej scharakteryzować zmiany patologiczne, przyjęliśmy 6-stopniowy system punktacji do opisania ciężkości uszkodzenia płuc od najmniej do najcięższego: 0, –; 1, +; 2, ++; 3, +++; 4, ++++; i 5, +++++ ( Rysunek uzupełniający 1 ; materiały uzupełniające dostępne online wraz z tym artykułem; https://doi.org/10.1172/jci.insight.123158DS1). W kontrolnej grupie zaszczepionej 5 makaków wykazało niewielkie zapalenie z niewielkim poszerzeniem przegród i naciekiem komórek zapalnych, które oceniliśmy jako + (CL23, CE25, CE20, CE21 i CL19; Figura 1D , Figura uzupełniająca 1B i Figura uzupełniająca 2 ). Dwa makaki wykazywały umiarkowane zapalenie z większą liczbą śródmiąższowego jednojądrzastego nacieku zapalnego i zostały ocenione jako ++ (CL26, CE24; Rycina uzupełniająca 1C i Rycina uzupełniająca 2 ). Tylko 1 makak wykazywał typowe objawy ostrego DAD z rozległym wysiękiem i naciekiem komórkowym w 35 dpi (CL22, punktacja ++++; Uzupełniająca Rycina 2). W grupie zaszczepionej ADS-MVA 4 makaki wykazywały typowe objawy ostrego DAD z rozległym wysiękiem i wielokomórkowym naciekiem w jamach zębodołowych (SL11, SE12, SL16 i SL18, punktacja ++++; Uzupełniająca Rycina 1E i Uzupełniająca Figura 2 ). Jeden makak wykazał ostry ostry DAD z wysiękiem, szklistą błoną wzdłuż pęcherzyków, złuszczaniem pneumocytów i uszkodzonym pęcherzykiem wypełnionym krwotokiem i komórkami zapalnymi (SL15, punktacja +++++; Figura 1D ). Jeden makak wykazywał wczesne objawy ostrego DAD (SL14, punktowane jako +++; Uzupełniająca Rycina 1D ), a pozostałe 2 makaki wykazywały umiarkowane zapalenie (SE13 i SE17, punktowane jako ++; Uzupełniająca Rycina 2). Porównanie wyników histopatologicznych płuc w 2 grupach wykazało znacząco nasilone uszkodzenie płuc w grupie zaszczepionej ADS-MVA zarówno w 7, jak i 35 dpi w porównaniu z grupą kontrolną ADC-MVA, co sugeruje, że S-specyficzna — ale nie MVA — odporność promuje ALI podczas infekcji SARS-CoV ( Figura 1E ). Co więcej, istnieje umiarkowana korelacja między wynikami patologicznymi płuc a mianami surowic NAb w 0 dpi ( Figura 1F ), co sugeruje rolę przeciwciała S-specyficznego we wzmacnianiu uszkodzenia płuc, w którym pośredniczy SARS-CoV.

Anty-S-IgG wywołało ciężkie uszkodzenie płuc podczas ostrej infekcji SARS-CoV. W poprzednim badaniu, w szczepieniu chińskiego makaków SARS-CoV PUMC (1 x 10 5 TCID 50 ), doprowadziło do dolnych dróg oddechowych u wszystkich zwierząt w ciągu 2 dni ( 25 ). Jednak większość z nich szybko ustąpiła infekcji w płucach, a wszystkie zwierzęta ( n = 8) wykazywały łagodne zmiany w płucach przed 3 dpi ( 25 ). Ciężkie uszkodzenie płuc u makaków chińskich zakażonych SARS-CoV nie zostało wykryte do 7 dpi (26 ,27 ). Aby określić wpływ przeciwciała anty-S na zakres uszkodzenia płuc, w którym pośredniczy SARS-CoV, przenieśliśmy 5 mg (niska dawka) i 200 mg (wysoka dawka) oczyszczonego anty-S-IgG ze szczepionego ADS-MVA, ale niezakwestionowane makaków na 2 grupy nieszczepionych makaków ( n = 6 / grupę) przez wstrzyknięcie do żyły, a następnie w prowokowanych odbiorców SARS-CoV PUMC (1 x 10 5 TCID 50 ) ( Figura 2A). Jako kontrole, kolejnym 2 makakom podano 200 mg kontrolnej IgG (C-IgG) pochodzącej z makaków szczepionych ADC-MVA. Poświęciliśmy połowę makaków w każdej grupie w 2 dpi, aby uniknąć potencjalnego zakłócenia przez przeciwciała indukowane infekcją wirusową przeciwko białku nukleokapsydowemu (N) i innym białkom wirusowym — i przed tym, kiedy zwykle obserwowano indukcję ALI. Pozostałą połowę makaków w każdej grupie uśmiercono w 21 dpi w celu oceny długoterminowego wpływu ( Figura 2A ). W dniu 2, surowice makaków otrzymujących o niskiej i wysokiej dawki S-IgG wykazywały aktywność neutralizującą z IC 50 wartości w zakresie od 10-260 i 1000-10000, co odpowiada dawce przenoszenia sera; makaki, które otrzymały C-IgG nie wykazały aktywności neutralizującej ( Figura 2B iTabela uzupełniająca 1 ). Podczas gdy miana NAb w surowicach makaków w grupie z wysoką dawką stale spadały między 2 a 21 dpi, makaki w grupach z niską dawką i w grupie kontrolnej wykazywały z czasem zwiększone miana NAb ( Figura 2B ), co sugeruje aktywną replikację wirusa. Rzeczywiście, SARS-CoV RNA wykryto stosując RT-PCR w czasie rzeczywistym na wymazach z jamy ustnej i/lub wirus odzyskano z tkanki płucnej zarówno u zwierząt kontrolnych, jak i 5 z 6 zwierząt (83%) w grupie otrzymującej niską dawkę. Tylko 2 z 6 zwierząt (33%) w grupie z wysoką dawką było wirusowym RNA + ( Figura 2C i Tabela Uzupełniająca 1 ), co sugeruje zmniejszoną produkcję wirusa przez wysokie dawki S-IgG.

Przeciwciała przeciw kolcom indukowały ALI w chińskim makaku rezus zakażonym SARS-CoV
Rysunek 2Przeciwciała przeciwko kolcom indukowały ALI u chińskich makaków rezus zakażonych SARS-CoV. A ) Projekt eksperymentalny wykorzystany do zbadania wpływu S-IgG na uszkodzenie płuc wywołane przez SARS-CoV. Dwie grupy chińskich makaków rezus ( n = 6/grupa) poddano wstrzyknięciu iv wysokiej dawki (200 mg) lub niskiej dawki (5 mg) oczyszczonej S-IgG z makaków zaszczepionych ADS-MVA, ale nieprowokowanych. Jako kontrole, kolejnym 2 makakom podano 200 mg C-IgG pochodzącego z makaków szczepionych ADC-MVA. Po 2 dniach, 3 grupy makaków eksponowano w SARS-CoV PUMC (1 x 10 5 TCID 50 ). Połowę zwierząt z każdej grupy uśmiercono w 2 i 21 dpi. ( B) Surowice z makaków we wskazanych punktach czasowych badano pod kątem zdolności do neutralizacji pseudotypu wirusa SARS-CoV. ( C ) Wykrywanie wirusowego RNA w wymazach z jamy ustnej. RNA SARS-CoV wykryto za pomocą zagnieżdżonej reakcji RT-PCR w wymazach z jednego z makaków leczonych dużą dawką S-IgG ( n = 6), 3 makaków leczonych niską dawką S-IgG ( n = 6) oraz 2 makaki traktowane C-IgG ( n = 2) we wskazanych punktach czasowych. Lewa oś y przedstawia liczbę kopii wirusowego RNA na mililitr wymazu. Prawa oś y przedstawia miana NAb w surowicy każdego makaka w 2 dpi, które są wyróżnione zacienionym obszarem. ( D) Zmiany patologiczne tkanki płucnej (200×). Skrawki makaków barwiono H&E. Obrazy pokazują objawy ostrego DAD występującego u makaków otrzymujących wysokie i niskie dawki S-IgG ( n = 12) z rozległym wysiękiem (czerwone strzałki), błonami szklistymi (czarne strzałki) i masywnym naciekiem komórkowym (żółte strzałki) w 2 i 21 dpi. Prawy panel przedstawia niewielkie i umiarkowane zapalenie u makaków otrzymujących C-IgG z niewielkim poszerzeniem przegród pęcherzykowych i rzadką infiltracją monocytów w 2 i 21 dpi. ( E ) Wyniki histopatologiczne grup otrzymujących wysoką i niską dawkę S-IgG, w tym próbki płuc zebrane zarówno w 2, jak i 21 dpi, porównano z grupą C-IgG. Patrz Uzupełniająca Rycina 1, aby zapoznać się ze wskaźnikiem punktacji opartym na ciężkości histopatologii płuc.

Zgodnie z wynikami w grupie kontrolnej zaszczepionej ADC-MVA, badanie histopatologiczne płuc wykazało łagodne i umiarkowane zapalenie odpowiednio w 2. i 21. dniu u biorców C-IgG. W przeciwieństwie do tego, wszyscy biorcy S-IgG wykazywali objawy ostrego DAD z różnym stopniem wysięku, tworzenia błony szklistej oraz krwotokiem i komórkami zapalnymi w pęcherzykach zarówno w dniu 2, jak i 21 ( Figura 2, D i E oraz Tabela uzupełniająca 2 ). Warto zauważyć, że pomimo obecności surowiczych NAb o wysokim mianie podczas przewlekłego stadium infekcji ( Figura 1B i Figura 2B ), tylko 1 z 5 biorców szczepionki C-IgG i kontrolnej szczepionki ADC-MVA wykazywał ostry DAD ( Figura 1E i Figura 2E).), wskazując na ograniczoną czasowo rolę S-IgG, która głównie powoduje ciężkie ALI u ostro zakażonych makaków. W związku z tym wnioskujemy, że pomimo supresji wirusa obecność S-IgG w ostrym stadium zakażenia SARS-CoV powodowała ciężkie ALI, które utrzymuje się do późnych stadiów.

S-IgG nie zapobiegło zakażeniu dolnych dróg oddechowych SARS-CoV i wzmocniło infiltrację i akumulację IMM w płucach. Aby określić potencjalną przyczynę ALI wzmocnionego S-IgG, zmierzyliśmy infekcję wirusową i naciek monocytów/makrofagów w płucach oraz profil cytokin w surowicy w 2 dpi. Wcześniej odkryliśmy, że infekcję płucną u makaków chińskich można szybko opanować. Wirusowe komórki RNA + były wykrywalne w płucach tylko 2 z 4 zwierząt w 2 dpi, chociaż wszystkie z nich były dodatnie pod względem nukleoprotein wirusowych (NP + ) w płucach i wnękowych węzłach chłonnych (LN), gdzie limfatyka płuc odpływ ( 25 ). Dlatego zmierzyliśmy wirusowe RNA +komórek przez hybrydyzację in situ (ISH), jak również sygnały NP w płucach i wnękowych LN przez barwienie IHC w celu oceny rzeczywistego zakażenia płuc każdego makaka. Zgodnie z wynikami izolacji wirusa ( Tabela uzupełniająca 1 ), wirusowe RNA wykryto w pneumocytach 1 makaka w wysokiej dawce (HS02, 33%), 2 makaka w niskiej dawce (LS01, LS02; 66%), i makaka leczonego C-IgG ( Figura 3A i Tabela Uzupełniająca 3 ), co sugeruje zmniejszenie produktywnej infekcji przez S-IgG. Jednak przeciwciało przeciw NP zidentyfikowało pozytywne sygnały w płucach i wnękowych LN wszystkich biorców S-IgG i C-IgG (7 z 7 makaków), ale nie zdrowych kontroli ( ryc. 3B i tabela uzupełniająca 3), co sugeruje, że S-IgG nie zapobiegło wejściu SARS-CoV, a SARS-CoV spowodował zakażenie dolnych dróg oddechowych u wszystkich prowokowanych zwierząt.

Zakażenie SARS-CoV i infiltracja monocytów/makrofagów w płucach C
Rysunek 3Zakażenie SARS-CoV i infiltracja monocytów/makrofagów w płucach makaków traktowanych C-IgG i S-IgG w 2 dpi. A ) Reprezentatywne obrazy komórek SARS-CoV RNA + (TRITC) i AE1/AE3 + (FITC) w płucach zakażonych makaków (białe strzałki). Górne zdjęcie przedstawia przegląd w małym powiększeniu (200×); dolne zdjęcie pokazuje obszar w ramce na górnym zdjęciu. ( B ) Reprezentatywne obrazy immunobarwienia białka wirusowego (NP) płuc i wnękowych węzłów chłonnych (LN) 7 zakażonych i 3 niezakażonych zwierząt (TRITC, białe strzałki) (oryginalne powiększenie, 200x). ( C) Reprezentatywne obrazy wirusowego NP i monocytów/makrofagów. Skrawki te wykazały znacząco zwiększone IMM w płucach grupy S-IgG w porównaniu z grupą C-IgG (MAC387 + , CD163 + lub CD68 + ; niebieskie strzałki). Próbki tkanek są podwójnie immunobarwione na SARS-CoV NP (TRITC) i markery makrofagów, w tym MAC387 (FITC), CD163 (FITC) i CD68 (FITC). W panelu reprezentatywnych obrazów dla grup C-IgG i S-IgG, lewy panel przedstawia przegląd w małym powiększeniu; prawy panel pokazuje obramowany obszar w lewym panelu (pierwotne powiększenie, 200×).

Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami dotyczącymi naiwnych makaków chińskich zaszczepionych SARS-CoV ( n = 4) ( 25 ), podwójne immunobarwienie przeciwciałem przeciw NP i przeciwciałami specyficznymi dla stadiów różnicowania makrofagów i zapalenia (MAC387, CD68, CD163) ujawniło znaczną infiltrację IMM w płucach biorców C-IgG, składających się z nowo nacieczonych (MAC387 + ) i zapalnych (CD163 + ) monocytów/makrofagów ( Figura 3C i Uzupełniająca Figura 3 ). Komórki CD163 + znacznie przewyższały populację CD68 + i zazwyczaj gromadziły się wokół komórek NP + , tworząc klastry komórkowe ( ryc. 3C), wykazując związek między infekcją wirusową a infiltracją IMM u tych makaków.

W porównaniu z biorcami C-IgG, silniejsze sygnały dla MAC387 i CD163 zidentyfikowano w płucach biorców S-IgG ( Figura 3C i Figura Uzupełniająca 3 ), co sugeruje wzmocnioną infiltrację IMM przez S-IgG. Monocyty /makrofagi MAC387 + i CD163 + nie tylko gromadziły się wokół komórek NP + , ale także tworzyły skupiska w tkankach z niewielkim sygnałem dla NP ( Figura 3C ), co sugeruje, że indukowana infekcją rekrutacja z krążenia trwała po usunięciu wirusa i akumulowała się w miejscu objętym stanem zapalnym. Ponadto znaleziono bardziej skoncentrowane sygnały CD68 + , co wskazuje na zmienioną funkcjonalną odpowiedź makrofagów na leczenie S-IgG ( Figura 3C). Konsekwentnie, podwyższone poziomy IL-8 w surowicy obserwowano u makaków leczonych dużą dawką S-IgG w 2 dpi ( Rysunek uzupełniający 3 ), a poziomy IL-8 są silnie skorelowane z mianami NAb anty-SARS-CoV ( Rysunek uzupełniający 3 ). IL-8 jest cytokiną zapalną pochodzącą z makrofagów ważną w inicjacji ALI. Wyniki te sugerują zatem, że S-IgG prawdopodobnie zmieniła funkcjonalną odpowiedź makrofagów w płucach podczas ostrej infekcji, skutkowała wzrostem produkcji IL-8 oraz zwiększoną infiltracją i akumulacją ALI i IMM.

Monocyty/makrofagi pęcherzykowe przyjęły funkcję gojenia ran już w 2 dpi u makaków nieleczonych S-IgG. Aktywacja makrofagów jest dynamiczna i plastyczna. Różne statuy aktywacji monocytów/makrofagów pełnią różne wyspecjalizowane i krytyczne w czasie role, biorąc udział w inicjacji i utrzymaniu lub rozwiązaniu stanu zapalnego ( 9 ). Dobrze zorganizowana reakcja gojenia się rany prowadzi do szybkiego ustąpienia stanu zapalnego, podczas gdy zaburzenia w gojeniu się rany skutkują trwałym stanem zapalnym i urazem. Aby zrozumieć nadmierny stan zapalny wywołany przez S-IgG, zdefiniowaliśmy dalej heterogeniczność makrofagów i statuy aktywacji w zmianach płucnych u biorców C-IgG ( n = 1) i S-IgG ( n= 3) przy 2 dpi. Trzy zdrowe makaki i 4 naiwne chińskie makaki poddane prowokacji tą samą dawką SARS-CoV PUMC i poddane skaryfikacji w 2 dpi z poprzedniego badania włączono jako kontrole ( 25 ).

Łącząc 5 markerów makrofagów (MAC387, CD68, CD163, HAM56 i CD206) ( 28 –30 ), 2 subpopulacje rezydentnych makrofagów zostały pokazane w płucach chińskich makaków rezus w stanie stacjonarnym, jak opisano wcześniej (29 ). Są to makrofagi śródmiąższowe (IM; MAC387 + HAM56 – CD206 – ) ( Rysunek 4A ) i rezydentne makrofagi pęcherzykowe (AM; CD68 + HAM56 – ) wyrażające niski poziom CD163 i CD206, markera specyficznego dla odpowiedzi makrofagów na gojenie ran, odpowiadającej do ich wewnętrznej funkcji przeciwzapalnej ( Figura 4B ) (29 ). W zmianach płucnych zarówno leczonych C-IgG, jak i naiwnych grup makaków prowokowanych SARS-CoV PUMC , IMM dalej scharakteryzowano i podzielono na 2 subpopulacje. Jeden subpopulacji był ostatnio rekrutowani MAC387 + HAM56 – CD68 – monocytów ( Figura 4C ) (29 ), który jest podobny do IM, ale ma większy rozmiar i jest głównie koeksprymowany CD163 ( rysunek uzupełniający 4 ). Inną subpopulacją były pojedynczezapalne makrofagiCD163 + , które odróżniły się od nowo zrekrutowanychmonocytów/makrofagówMAC387 + ( Rysunek 4D i Rysunek uzupełniający 4 ) (29 ). Co ważne, rezydentne AM (CD68 + ) różnicowały się dokomórekHAM56 + , z niewielkim wzrostem liczby i zwiększonym rozmiarem, z silniejszym barwieniem CD163 i – co ważniejsze – CD206, co sugeruje, że są one alternatywnie aktywowane ( Figura 4D ). Co uderzające, podwyższone poziomy ekspresji TGF-β wykryto we wszystkich MAC387 + — i większości powiększonych CD163 + —, a także CD68 + w płucach makaków zarówno leczonych, jak i nieszczepionych C-IgG w porównaniu ze zdrowymi kontrolami ( Ryc. 4, G –I ), wskazując, że wiele IMM i aktywowanych rezydentów AM przejęło funkcję gojenia ran w zakażonych płucach w ciągu 2 dni od zakażenia.

Porównanie fenotypu monocytów/makrofagów i funkcji w płucach S-
Rysunek 4Porównanie fenotypu monocytów/makrofagów i funkcji w płucach makaków leczonych S-IgG i C-IgG. A–F ) Fenotyp subpopulacji monocytów/makrofagów w płucach zdrowych makaków leczonych C-IgG- i S-IgG (pierwotne powiększenie 200x). Te skrawki były potrójnie immunobarwione przeciwciałami dla CD206 (cyjan), HAM56 (FITC) i MAC387 (TRITC) ( A , C i E ); CD206 (cyjan), HAM56 (FITC) ( B , D i F ) i CD68 (TRITC) (górny panel w B , D i F ); lub CD163 (TRITC) (dolny panel w B , D , iF ). I B pokazują, 2 subpopulacje w stanach stałych, w tym śródmiąższowego makrofagów (im) (MAC387 + HAM56  CD206  ) (żółte strzałki) zamieszkałej makrofagów pęcherzykowych (AM) (CD68 + CD163 lo CD206 lo HAM56  ) (białe strzałki) . C i D pokazują obecność alternatywnie aktywowanych rezydentnych AM i nagromadzonych IMM w grupie C-IgG. Alternatywnie aktywowane AM to CD206 hi CD68 + CD163 hi HAM56 + ( D , białe strzałki). Komunikatory to MAC387+ HAM56  CD206  ( C , żółta strzałka). IMM obejmują nowo naciekające monocyty/makrofagi (MAC387 + ) ( C , zielona strzałka); i makrofagi zapalne (CD163 + CD68  CD206  HAM56  ) ( D , zielona strzałka). E i F wykazują znacznie zwiększoną liczbę IMM i zmniejszoną liczbę alternatywnie aktywowanych makrofagów w grupie S-IgG. IMM obejmują nowo naciekające monocyty/makrofagi (MAC387 + ) ( E , zielona strzałka) i zapalne makrofagi będące CD68 +HAM56  (zielona strzałka F , górny panel) i CD163 + CD206  HAM56  (zielona strzałka F , dolny panel). Rezydentne AM nie wyrażają już CD206 (CD68 + HAM56 + CD163 + CD206  ) (niebieska strzałka, F , górny panel). ( G-J ) Ekspresja TGF-β i IL-6 w makrofagach w płucach. Skrawki te były podwójnie immunobarwione przeciwciałami dla TGF-β lub IL-6 (TRITC) i MAC387, CD163 lub CD68 (FITC). G wykazuje niski poziom ekspresji TGF-β i IL-6 w IM (MAC387 + ) i AM (CD68 +) u zdrowych makaków. H pokazuje zwiększoną ekspresję TGF-β w grupie C-IgG (białe strzałki), ale zwiększoną IL-6 w grupie S-IgG (niebieskie strzałki). I i J pokazują liczbę monocytów/makrofagów TGF-β + i IL-6 + w 3 grupach w polu 200x.

Leczenie S-IgG wypaczyło odpowiedź makrofagów na gojenie ran w płucach podczas ostrej infekcji SARS-CoV. W porównaniu z makakami nieleczonymi S-IgG, liczba IMM (MAC387 + i CD163 + HAM56  ) znacznie wzrosła u biorców S-IgG ( Figura 4, E i F ). Co więcej, wielu niedawno zrekrutowanych MAC387 + HAM56  monocyty/makrofagi nie eksprymowały CD163 ( rysunek uzupełniający 4 ), reprezentujących najnowsze zrekrutowane monocyty krwi, w wyniku zwiększonej infiltracji monocytów przez S-IgG. Co ważne, większość CD163 + HAM56  IMM koeksprymuje CD68 ( rysunek uzupełniający 4), sugerując zmianę funkcji tej subpopulacji przez S-IgG. Ponadto makrofagi rezydujące (CD68 + HAM56 + ) w płucach biorców S-IgG nie wyrażają już CD206, co — otoczone wieloma IMM CD163 + ( ryc. 4F ) — sugeruje utratę funkcji gojenia ran i rolę w rekrutacji monocyty krwi. Konsekwentnie, makaki traktowane S-IgG wykazywały utratę TGF-β i wysoką ekspresję IL-6 we wszystkich subpopulacjach makrofagów ( Figura 4, G, H i J ). IL-6 sprzyja akumulacji makrofagów w miejscu uszkodzenia i jest ważna dla rozwoju przetrwałego zapalenia i ALI (31 ,32 ). Dlatego dochodzimy do wniosku, że chociaż AM uległy zmianom fenotypowym i czynnościowym w ostrych zakażonych płucach, wiele monocytów/makrofagów przyjęło funkcję gojenia ran w celu ustąpienia stanu zapalnego, ale obecność S-IgG wypaczyła odpowiedź na gojenie się ran, prowadząc do niekontrolowanego stanu zapalnego. i uszkodzenie tkanek.

Rozpoczęcie odpowiedzi przeciwciał przed usunięciem wirusa jest związane ze zniesieniem odpowiedzi na gojenie ran i zwiększoną infiltracją płuc IMM u nieszczepionych chińskich makaków rezus. Aby zrozumieć mechanizm leżący u podstaw ograniczonej w czasie roli S-IgG w promowaniu ALI, przeprowadziliśmy analizę czasową produktywnej infekcji wirusowej, odpowiedzi przeciwciał i zmian funkcjonalnych makrofagów u nieszczepionych makaków chińskich w pierwszym tygodniu infekcji. Naiwne makaków eksponowano przy użyciu 1 x 10 5 TCID 50 SARS CoV PUMC i uśmiercono po 2, 3 i 7 dpi (4 makaków / grupę) ( Figura 5A ) (25 ). Skuteczne zakażenie dolnych dróg oddechowych zostało potwierdzone przez wykrycie wirusowego NP za pomocą barwienia IHC w płucach wszystkich makaków (25 ). Wirusowe RNA + pneumocyty pęcherzykowe znaleziono głównie w 2 dpi (2 z 4 makaków), a rzadko w 3 dpi (0 z 4 makaków; Ryc. 5B i tabela uzupełniająca 4 ) (25 ). W 7 dpi wirusowy RNA był wykrywalny w płucach 2 makaków, AD0516 i AD0518, co sugeruje produktywną infekcję tam ( Figura 5, B i C ). Tylko kilka rozproszonychkomórekNP + znaleziono w AD0517 ( Figura 5D ). Ani NP, ani wirusowy RNA nie wykryto w płucach lub wymazach AD0515, co sugeruje usunięcie produktywnej wirusowej infekcji płuc u tego makaka ( Figura 5D i Tabela Uzupełniająca 4 ). NAb w surowicy nie zaobserwowano w 2 i 3 dpi do 7 dpi u 2 z 4 makaków, AD0515 i AD0516 ( Tabela Uzupełniająca 4 i Figura 5E ).

Dynamika replikacji wirusa, odpowiedź przeciwciał i aktywacja makrofagów
Rysunek 5Dynamika replikacji wirusa, odpowiedź przeciwciał i aktywacja makrofagów podczas ostrej infekcji SARS-CoV. A ) Schemat eksperymentalny. W sumie 12 chińskich makaków rezus eksponowano w SARS-CoV PUMC (1 x 10 5 TCID 50 ). Każde z czterech zwierząt uśmiercono w 2, 3 i 7 dpi. ( B ) Wykrywanie SARS-CoV RNA metodą ISH w płucach w 2, 3 i 7 dpi (pierwotne powiększenie 200 ×). Wirusowe RNA + (TRITC) pneumocyty typu I (FITC) stwierdzono w 2 dpi ( n = 2) i 7 dpi ( n = 1). ( C) Wirusowe RNA w wymazach i homogenatach płuc w 7 dpi. SARS-CoV RNA wykryto przy użyciu zagnieżdżonej reakcji RT-PCR w wymazach z 3 makaków (AD0516, AD0517 i AD0518) i homogenatach płuc makaków AD0516. ( D ) Antygen wirusowy i nacieki zapalne w płucach w 7 dpi (200x). Skrawki te wybarwiono na SARS-CoV NP (czerwony) i jądro (niebieski) metodą IHC, wykazując sygnał NP w komórkach makrofagopodobnych w AD0516 i AD0517 (czerwone strzałki) oraz pneumocyty typu I w AD0518 (niebieskie strzałki), ale znaczny nacieki zapalne obserwowano tylko w AD0516 (zielone strzałki). ( E ) Aktywność neutralizująca surowicę. Aktywność neutralizującą surowicę wykryto u makaków AD0515 i AD0516 w 7 dpi. ( F–I) Zmniejszona odpowiedź gojenia ran u makaków z produktywną infekcją wirusową płuc i aktywnością neutralizującą surowicę (200x). Skrawki te były podwójnie barwione immunologicznie na TGF-β (TRITC) i CD163 (FITC) lub potrójnie barwione na CD206 (cyjan), HAM56 (FITC) i CD163 (TRITC). Rysunek pokazuje, że odpowiedź gojenia ran miała miejsce w ciągu 2 dpi, z naprzemiennie aktywowanymi monocytami/makrofagami (TGF-β + i CD206 + , białe strzałki) i IMM (CD163 + CD206  , zielone strzałki) współistniejącymi w płucach ( F ) . Po usunięciu wirusa, IMM zmniejszają się w 3 dpi ( G ), a homeostaza została przywrócona w 7 dpi (AD0515) ( H ). Gdy wirusowa infekcja płuc utrzymuje się, IMM (CD163+ CD206  , zielone strzałki) nasila się infiltracja i akumulacja, a makrofagi gojące rany (CD206 + ) są zmniejszone u makaków, które wykazują szybszą odpowiedź NAb (AD0516) ( I ).

Zgodnie z ustaleniami w grupie C-IgG, analiza czasowa heterogeniczności makrofagów wykazała znacząco zwiększoną liczbę IMM (CD163 + CD206  ) w wirusowym RNA + płucach w 2 dpi ( Figura 5F , prawy obraz). IMM zmniejszyły się w 3 dpi (4 z 4 makaków) ( Rysunek 5G ) i stały się prawie całkowicie nieobecne w 7 dpi u makaków bez produktywnej infekcji wirusowej płuc (2 z 4 makaków, AD0515 i AD0517) ( Rysunek 5H ), co wskazuje na odpowiedź zapalną rozwiązany w ciągu 7 dni po opanowaniu infekcji produktywnej. Krytycznie, gojące się rany makrofagi (CD163 + CD206 + i CD163 + TGF-β +) zaobserwowano w płucach wszystkich makaków w 2 dpi, pomimo produktywnej infekcji wirusowej płuc u makaków AD0506 i AD0508 ( Figura 5F ). W przeciwieństwie do tego, makak AD0516, z surowiczymi NAb i produktywną infekcją wirusową w płucach, wykazywał znacznie wzmocnioną prozapalną odpowiedź makrofagów i zmniejszoną zapalną odpowiedź makrofagów ( Figura 5I ), czego nie obserwowano u makaków z produktywną infekcją wirusową, ale niewykrywalne odpowiedzi NAb ( AD0518) lub makaków z wykrywalnymi NAb, ale niewykrywalną replikacją wirusa (AD0515) ( Rysunek 5D i tabela uzupełniająca 4). Dlatego trwała replikacja wirusa i współistniejące wykrywanie NAb są związane ze zwiększoną infiltracją płuc IMM i zmniejszoną liczbą makrofagów gojących rany.

S-IgG modyfikuje funkcjonalną odpowiedź alternatywnie, ale nie klasycznie aktywowanych makrofagów na zakażenie SARS-CoV.Aby ustalić, czy S-IgG wypacza odpowiedź na gojenie się ran poprzez modyfikację funkcjonalnej odpowiedzi makrofagów w gojeniu się rany podczas infekcji SARS-CoV, przez 20 godzin leczyliśmy spolaryzowane, alternatywnie aktywowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów (MDM) in vitro przez 20 godzin pseudowirusem SARS-CoV i inaktywowane termicznie surowice makaków poddanych działaniu wysokich dawek S-IgG (surowice S-IgG) zebrane w 2 dpi. Następnie zmierzyliśmy stężenia 13 cytokin zapalnych w supernatantach z hodowli komórkowych, w tym IL-1β, IFN-α, IFN-γ, TNF-α, MCP1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL -17A, IL-18, IL-23 i IL-33. Surowice od biorców C-IgG lub zdrowych makaków włączono jako kontrole. Przebadano również in vitro spolaryzowaną klasycznie aktywowaną MDM i porównano ją równolegle z alternatywnie aktywowaną MDM. Zgodnie z poprzednim raportem, niestymulowana klasycznie aktywowana MDM wytwarzała wysokie poziomy IL-8 i IL-6; alternatywnie aktywowany MDM wytwarzał jedynie minimalne poziomy tych cytokin (Figura 6A ). Dodanie pseudowirusa SARS-CoV indukowało wytwarzanie IL-8 w alternatywnie aktywowanej MDM do poziomów porównywalnych z tymi znajdowanymi w niestymulowanej, klasycznie aktywowanej MDM, jak również w niskim poziomie wytwarzania MCP1 i IL-6 ( Figura 6B ). Z kolei pseudowirus SARS-CoV powodował mniej niż 1-krotny wzrost wydzielania IL-8, ale nie innych cytokin, przez klasycznie aktywowany MDM ( Figura 6C). Co zaskakujące, podczas gdy żadna z próbek surowic nie indukowała wytwarzania cytokin, gdy były podawane wyłącznie do MDM, podawanie surowic S-IgG powodowało zależny od dawki wzrost wytwarzania wszystkich 3 cytokin zapalnych w stymulowanej SARS-CoV alternatywnie aktywowanej MDM. przy ponad 10-krotnym wzroście IL-6, 8-krotnym wzroście MCP1 i 5-krotnym wzroście IL-8 ( Figura 6, D i E ). Jednak tego wzmocnienia nie zaobserwowano, gdy surowice S-IgG zostały zastąpione surowicami od biorców C-IgG lub zdrowych makaków ( Rysunek 6, F, G i H), co sugeruje, że S-IgG, ale nie inne składniki surowic, wzmacniały stymulowane przez SARS-CoV wytwarzanie cytokin przez alternatywnie aktywowany MDM. Podawanie surowic S-IgG nie miało wpływu na wytwarzanie cytokin przez klasycznie aktywowaną MDM traktowaną SARS-CoV ( ryc. 6, I, J i K), wskazując, że S-IgG nie moduluje, w której pośredniczy wirus, klasycznie aktywowanej odpowiedzi funkcjonalnej makrofagów. MCP1 i IL-8 to kluczowe cytokiny, które regulują migrację monocytów/makrofagów i promują infiltrację neutrofili, podczas gdy IL-6 sprzyja trwałemu zapaleniu i urazom. Wyniki te sugerują, że w odpowiedzi na zakażenie SARS-CoV gojące się rany makrofagi wytwarzają IL-8 i małe ilości MCP1 w celu rekrutacji neutrofili i monocytów krwi, podczas gdy obecność S-IgG może skutkować 5- do 10-krotnym wzrostem w wytwarzaniu IL-8, MCP1 i IL-6 przez makrofagi gojące rany, co prowadzi do znacznie zwiększonej i trwałej infiltracji monocytów i uszkodzenia tkanek. Co krytyczne, w obecności przeciwciała blokującego receptor Fcγ (FcγR),Figura 6L ). W związku z tym wnioskujemy, że S-IgG bezpośrednio modyfikuje funkcjonalną odpowiedź alternatywnie aktywowanych makrofagów podczas ostrej infekcji, w ten sposób zniekształcając odpowiedź na gojenie się ran, prowadząc do hipercytokinemii, agresywnego zapalenia i ciężkiego uszkodzenia płuc.

S-IgG znacząco wzmacniał produkcję prozapalnych cytokin przez SARS-C
Rysunek 6S-IgG znacząco wzmacniało produkcję prozapalnych cytokin przez alternatywnie aktywowane makrofagi traktowane SARS-CoV. Spolaryzowane in vitro alternatywnie aktywowane makrofagi pozostawiono niestymulowane lub inkubowano z samym pseudowirusem SARS-CoV lub hodowano razem z pseudowirusem SARS-CoV i rozcieńczonymi surowicami z grupy wysokich dawek S-IgG ( n = 6) lub grupy C-IgG ( n = 2) zebrane w 2 dpi lub ze zdrowych makaków ( n = 2) przez 20 godzin. Poziomy wydzielanych cytokin i chemokin mierzono w supernatancie hodowli i przedstawiono w postaci wykresu kolumnowego ( A-D i F-K ) oraz krotność lub procent w stosunku do supernatantów z makrofagów traktowanych samym wirusem ( EL ). A przedstawia poziomy IL-8 i IL-6 w supernatancie klasycznie aktywowanego i alternatywnie aktywowanego MDM przed leczeniem. B i C pokazują, że traktowanie SARS-CoV indukowało MCP1, IL-8 i bardzo niskie poziomy wytwarzania IL-6 przez alternatywnie aktywowany MDM, jak również zwiększone wytwarzanie IL-8 przez klasycznie aktywowany MDM. D i E pokazują, że surowice od biorców S-IgG powodowały zależny od dawki wzrost produkcji cytokin z leczonej SARS-CoV alternatywnie aktywowanej MDM. F-H pokazują, że wirus leczony alternatywnie aktywowanym MDM (VT), ale nie leczony lub nietraktowany surowicą komórki (UT), wydziela prozapalne cytokiny IL-8 ( F), MCP1 ( G ) i bardzo niskie poziomy IL-6 ( H ). Dodanie surowic (rozcieńczenia 1:4 000) z makaków (CT) lub zdrowych kontroli (HCT) z wysokimi dawkami S-IgG (HST), ale nie leczonych C-IgG, znacznie amplifikowana IL-8 ( F ), MCP1 ( G ) oraz wytwarzanie IL-6 ( H ). I-K pokazują, że dodanie surowic (rozcieńczenie 1:4 000) z dużych dawek poddanych działaniu S-IgG (HST), makaków poddanych działaniu C-IgG (CT) lub zdrowych kontroli (HCT) nie miało wpływu na IL-8 ( I ), MCP1 ( J ) i IL-6 ( K ) wytwarzanie przez klasycznie aktywowane MDM traktowane SARS-CoV. Lpokazuje, że blokada FcγR znacząco zmniejsza wydzielanie IL-8 wzmocnione przez surowicę odpornościową i częściowo zmniejsza wydzielanie MCP1. Dane reprezentują wartości średnie lub wartości średnie ± SEM z co najmniej 3 niezależnych eksperymentów. Do analizy statystycznej zastosowano dwustronny niesparowany test t- Studenta. * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001; **** P < 0,0001.

Zmarli pacjenci z SARS wykazywali wyższe poziomy NAb w surowicy, nagromadzenie prozapalne, infiltrację makrofagów i brak gojących się makrofagów w płucach. Aby zbadać rolę S-IgG w promowaniu ALI w warunkach klinicznych, zbadaliśmy odpowiedzi przeciwciał we wczesnym stadium infekcji w 2 grupach zmarłych pacjentów lub osób wyleczonych z SARS i scharakteryzowaliśmy heterogenność monocytów/makrofagów w płucach 3 zmarłych pacjentów z SARS. Barwienie H&E próbek płuc pochodzących od 3 zmarłych pacjentów z SARS ujawniło ciężki ALI ( Figura 7A ). Zgodnie z wynikami badań makaków, analiza IHC wykazała istotną infiltrację CD163 +monocyty/makrofagi do płuc pacjentów, z niewielką ekspresją TGF-β i utratą markera gojenia ran CD206 + , co wskazuje głównie na aktywację makrofagów prozapalnych i zmniejszoną odpowiedź zapalną ( Figura 7B ). Ponadto, znacząco wyższe poziomy anty-S NAb wykryto w surowicach zmarłych pacjentów ( n = 6) podczas ostrej infekcji w porównaniu z pacjentami wyzdrowiałymi ( n = 8) ( Figura 7C ). Wyniki te są zatem zgodne z odkryciami na eksperymentalnych makakach.

Odpowiedź NAb i analiza fenotypowa gromadzących się monocytów/makrofagów i
Rysunek 7Odpowiedź NAb i analiza fenotypowa gromadzących się monocytów/makrofagów w płucach u zmarłych pacjentów z SARS. A ) Zmiany patologiczne tkanki płucnej. Skrawki zmarłych pacjentów z SARS wybarwiono H&E. A reprezentuje 3 pacjentów (pierwotne powiększenie 100x), z objawami ostrego DAD z masywnym naciekiem komórkowym w jamach zębodołowych (niebieska strzałka). ( B)Masywne nagromadzenie IMM i brak odpowiedzi makrofagów gojących rany w płucach zmarłych pacjentów. Skrawki te były potrójnie immunobarwione przeciwciałami przeciwko CD206 (cyjan), HAM56 (FITC) i CD163 (TRITC) lub podwójnie immunobarwione TGF-β (TRITC) i CD163 (FITC) (oryginalne powiększenie, 200x). Prawy panel na lewym obrazie pokazuje pojedyncze kolory z lewego obrazu (200×). Te reprezentatywne obrazy pokazują akumulację IMM (CD163 + CD68  CD206  HAM56  , białe strzałki) i brak odpowiedzi na gojenie ran, na co wskazuje utrata sygnału dla CD206 (cyjan, B1) i TGF-β (TRITC, B2 ) w płucach. ( C ) Aktywność neutralizująca surowicę przeciw SARS-CoV. Surowice pobrane od zmarłych (czerwone,n = 6) lub wyleczonych (niebieski, n = 8) Pacjenci z SARS we wczesnym stadium zakażenia byli badani pod kątem zdolności do neutralizacji pseudotypu wirusa SARS-CoV. Do analizy statystycznej zastosowano dwustronny niesparowany test t- Studenta.

Antysurowice od zmarłych pacjentów z SARS wypaczyły odpowiedź gojenia się ran podczas infekcji SARS-CoV częściowo przez FcγR. Aby zbadać, czy ludzkie przeciwciało anty-SARS-CoV modyfikuje odpowiedź gojenia ran podczas infekcji SARS-CoV, leczyliśmy spolaryzowane in vitro alternatywnie aktywowane MDM pseudowirusem SARS-CoV przez 20 godzin w obecności surowic pobranych od pacjentów z SARS podczas ostrej infekcji . Jako kontrole włączono makrofagi traktowane pseudowirusem SARS-CoV lub samą surowicą. Następnie zbadaliśmy poziomy białek cytokin/chemokin w supernatancie hodowli komórkowej. Zgodnie z wynikami badań u makaków, podanie surowic od zmarłego pacjenta z SARS (D1; Tabela uzupełniająca 5) na traktowany SARS-CoV alternatywnie aktywowany MDM spowodował zależny od dawki wzrost wytwarzania cytokin, prowadząc do 2- do 3-krotnego wzrostu MCP1 i IL-8 po 20 godzinach ( Figura 8, A i B ). Jednak tego wzmocnienia nie zaobserwowano w komórkach traktowanych samą surowicą ( Figura 8, A-D ). Podawanie surowic od pacjentów, którzy wyzdrowieli ( n = 8; Tabela uzupełniająca 5 ) nie miało wpływu na wytwarzanie cytokin z wyjątkiem 1 próbki ( Rysunek 8, C i D). Różnice te można przynajmniej częściowo wytłumaczyć niższymi mianami NAb, chociaż możliwe jest również, że surowice odzyskanych pacjentów zawierają różne populacje przeciwciał. Konsekwentnie, jedyna próbka surowicy — R2, która zwiększyła produkcję chemokin — ma stosunkowo wyższe miano NAb wśród badanych próbek ( Tabela uzupełniająca 5 ). Co więcej, analiza statystyczna pokazuje, że wytwarzanie IL-8 silnie koreluje z mianem NAb w surowicach zmarłych pacjentów ( Figura 8E ). Ponadto produkcja IL-8 została znacznie zmniejszona, gdy komórki leczono pseudowirusem SARS-CoV i surowicami od zmarłego pacjenta z SARS (rozcieńczony 1:4 000) w obecności przeciwciała blokującego FcγR, co wskazuje, że przeciwciało anty-SARS-CoV modyfikuje gojenie ran odpowiedź u ludzi częściowo przez FcγRs (Figura 8F ).

Surowice od zmarłych pacjentów z SARS wypaczyły odpowiedź makrofagów na gojenie ran p
Cyfra 8Surowice od zmarłych pacjentów z SARS wypaczyły odpowiedź makrofagów gojących ranę częściowo przez FcγR. Spolaryzowane in vitro alternatywnie aktywowane MDM albo pozostawiono bez stymulacji, albo inkubowano je z samym pseudowirusem SARS-CoV lub hodowano razem z pseudowirusem SARS-CoV i 1–400 000 serii rozcieńczonych lub 1/4 000 rozcieńczonych surowic od zmarłych ( n = 5) lub odzyskanych pacjentów z SARS ( n = 7) przez 20 godzin. Komórki traktowane surowicami od samych pacjentów służyły jako kontrole. Poziomy wydzielanych cytokin i chemokin mierzono w supernatancie hodowli i przedstawiono w postaci wykresu kolumnowego ( A , C i D ) oraz krotność lub procent w stosunku do supernatantów z makrofagów traktowanych samym wirusem ( B )F ). A i B pokazują, że dodanie surowic od zmarłego pacjenta (D1) w zależności od dawki zwiększało wytwarzanie IL-8, IL-6 i MCP1 przez traktowany SARS-CoV alternatywnie aktywowany MDM. C i D wykazują znacznie zwiększone wytwarzanie IL-8 i MCP1 przez alternatywnie aktywowane makrofagi traktowane surowicami od zmarłych pacjentów z SARS i wirusem w porównaniu z komórkami traktowanymi samym wirusem. Samo traktowanie surowicami nie indukowało wytwarzania IL-8 lub MCP1. ( E ) Korelacja produkcji IL-8 z mianami NAb surowic zmarłych pacjentów. Linie ciągłe oznaczają związek między wynikami histopatologicznymi a aktywnością neutralizującą surowicę. ( F) Blokada ludzkiego FcγR znacząco zmniejszyła wydzielanie IL-8 wzmocnione przez surowicę odpornościową i częściowo zmniejszyło wydzielanie MCP1. Spolaryzowane in vitro, alternatywnie aktywowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów hodowano wspólnie z pseudowirusem SARS-CoV i 1–4000 rozcieńczonymi surowicami od zmarłego pacjenta (D1) z lub bez przeciwciała blokującego FcγR przez 20 godzin. Poziomy wydzielanych cytokin i chemokin mierzono w supernatancie hodowli i przedstawiono w danych przedstawionych jako wzrost w stosunku do supernatantów z makrofagów traktowanych samym wirusem. Dane reprezentują wartości średnie lub wartości średnie ± SEM z co najmniej 3 niezależnych eksperymentów. Do analizy statystycznej zastosowano dwustronny niesparowany test t- Studenta i test korelacji rang Spearmana.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy dowody na szkodliwą rolę anty-S-IgG w ALI podczas infekcji SARS-CoV. Zakażenie wirusem CoVs stanowi wyjątkowe wyzwanie dla układu odpornościowego: nie tylko wirus musi być szybko eliminowany, ale zapalenie płuc musi być również kontrolowane, aby zapobiec ostrej niewydolności oddechowej ( 33).). W niniejszym badaniu pokazujemy, że pomimo znacznego obniżenia miana wirusa, przeciwciała anty-S-IgG powodowały uszkodzenie płuc we wczesnych stadiach infekcji, znosząc odpowiedź makrofagów gojenia się ran i produkcję TGF-β, jednocześnie promując prozapalną cytokinę IL-8 oraz produkcja MCP1 i akumulacja makrofagów zapalnych. Zgodnie z naszą wiedzą, nasze dane wykazują wcześniej nierozpoznany mechanizm leżący u podstaw ALI, w którym pośredniczy wirus, i sugerują, że modulacja odpowiedzi przeciwciał anty-S lub blokowanie receptorów Fcγ podczas ostrej infekcji może być potrzebne do skutecznego leczenia infekcji oddechowej CoV.

Wiele badań wykazało rolę NAb indukowanych przez glikoproteiny S w ochronie replikacji wirusa u podatnych gospodarzy, w tym myszy, fretek, chomików i makaków ( 24 ,34 ,35 ). Jednak wpływ S-specyficznej odporności na ochronę przed immunopatologią płuc jest kontrowersyjny. W niektórych przypadkach odporność wywołana szczepieniem wspomaga usuwanie wirusa i chroni myszy lub fretki przed śmiertelną prowokacją (36 –39 ), podczas gdy w wielu innych sytuacjach wiele platform szczepionek wydaje się indukować zwiększoną eozynofilową prozapalną odpowiedź płuc po prowokacji (18 ,23 ,40 ). Różnice te można częściowo wyjaśnić charakterystyką badanej szczepionki, dawką zakaźną i zastosowanym szczepem wirusa, a także rodzajem lub jakością wywołanej odpowiedzi immunologicznej. Ostatnie badania sugerują, że odpowiedź limfocytówTCD8 + odgrywa kluczową rolę w usuwaniu wirusa i ochronie myszy przed immunopatologią eozynofilową i śmiertelnym zakażeniem SARS-CoV, podczas gdy immunopatologia odzwierciedla głównie niewystarczającą odpowiedź Th1 wywołaną szczepionką ( 20 –23 ).

W rzeczywistości, o ile nam wiadomo, działanie ochronne przeciwko immunopatologii płuc, w której pośredniczy szczepionka oparta na pełnej długości białka S w modelach naczelnych innych niż człowiek zakażonych SARS-CoV, nie zostało opisane. Chociaż kilka kandydatów na szczepionki chroniło makaki przed replikacją wirusa w płucach, immunopatologia płuc nie była oceniana w tych badaniach ( 24 ,41 ,42 ). Wykazano natomiast, że pamięć immunologiczna specyficzna dla SARS-CoV wywołana wcześniejszą infekcją nasila zapalenie płuc po homologicznej prowokacji u afrykańskich małp zielonych (17 ). Podobnie, nasilenie choroby przez szczepienie zostało również opisane w badaniach atypowej odry i gorączki krwotocznej denga, a także kilku chorób układu oddechowego, w tym wirusa syncytialnego układu oddechowego (RSV) i grypy pandemicznej (16 ,43 ). W badaniu szczepionki przeciwko RSV przeprowadzonym w 1966 i 1967 80% zaszczepionych RSV wymagało hospitalizacji, podczas gdy tylko 5% zakażonych RSV dzieci w grupie kontrolnej wymagało przyjęcia, chociaż mechanizmy leżące u podstaw wirusa pozostają nie do końca poznane. Wykorzystując chińskie makaki rezus, pokazujemy, że szczepionka oparta na ADS-MVA chroniła makaki przed replikacją wirusa, ale znacząco zwiększała ostry DAD zarówno w 7, jak i 35 dpi w porównaniu z grupą kontrolną ADC-MVA, co sugeruje, że S-specyficzne, ale niespecyficzne wobec MVA odporność promuje ALI ( Rysunek 1). Do tej pory nie wiadomo, czy kandydaci na szczepionki SARS skupiające się na domenie wiążącej receptor (RBD) białka S mogą uniknąć indukcji ALI u naczelnych innych niż człowiek. Wykazano, że te szczepionki indukują bardzo silne odpowiedzi NAb i wywołują długotrwałą odporność ochronną u immunizowanych małych zwierząt (38 ).

Zakażenie SARS-CoV u makaków chińskich często charakteryzuje się szybką kontrolą replikacji wirusa z łagodnymi zmianami w płucach u większości makaków ( 25 ). Mechanizmy leżące u podstaw tego, dlaczego u makaków chińskich często nie rozwijają się ALI, jak zaobserwowano u większości pacjentów z SARS, są w dużej mierze nieznane. Nasze dane sugerują, że te efekty częściowo odzwierciedlają szybką kontrolę replikacji wirusa w płucach, która osiągnęła szczyt między 24 a 48 godziną po zaszczepieniu (hpi) i zmniejszyła się w ciągu 7 dni, tworząc w ten sposób przerwę między zapaleniem płuc a wysokim mianem przeciwciał produkcja w większości makaków. Rzeczywiście, chociaż infekcja SARS-CoV spowodowała znaczną infiltrację makrofagów w płucach, liczba makrofagów została gwałtownie zmniejszona po usunięciu wirusa w 3 dpi ( Figura 5). W 7 dpi zapalenie wydawało się w większości ustąpić ( Figura 5 ). Natomiast kontrola replikacji wirusa jest mniej skuteczna u pacjentów z SARS, a szczyt wiremii zbiega się z pierwszym pojawieniem się odpowiedzi przeciwciał około 10 dni po wystąpieniu objawów (6 ).

Jednak niski wskaźnik ALI i odstęp między ustąpieniem zapalenia płuc a produkcją przeciwciał sprawiają, że makaki chińskie są idealnym modelem zwierzęcym do niniejszego badania. Stosując szczepienie i immunizację bierną, kondycjonowaliśmy miana przeciwciał anty-S u makaków we wczesnym stadium infekcji, kiedy zwykle nie obserwowano ALI. Odkryliśmy, że wcześniejsze podanie anty-S-IgG prowadziło do masowej akumulacji monocytów/makrofagów w płucach w ciągu 2 dpi. Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami, w których myszy, którym podano szczepionkę SARS, wykazywały immunopatologiczną reakcję płuc po późniejszej prowokacji SARS-CoV ( 18 ,19 ). Ponadto u pacjentów z SARS przebieg kliniczny i wyniki są korzystniejsze u dzieci w wieku poniżej 12 lat w porównaniu z młodzieżą i dorosłymi (44 ), wskazując, że wcześniejsza alternatywna infekcja CoV może odgrywać rolę w prowadzeniu nasilonego zapalenia płuc. Niedawne badanie wykazało, że patogenne kompleksy immunologiczne sprzyjały uszkodzeniu płuc podczas pandemii H1N1 w 2009 roku (16 ). Nie wiadomo, czy kompleksy immunologiczne mogą również odgrywać rolę w kierowaniu ALI podczas infekcji SARS-CoV.

Szczegółowe analizy heterogeniczności makrofagów na różnych etapach infekcji oraz w płucach z ciężkim uszkodzeniem lub łagodną zmianą wykazały różne role makrofagów prozapalnych i gojących rany w progresji SARS. Zaobserwowaliśmy, że wczesne przejście odpowiedzi makrofagów z prozapalnej do gojenia się ran ze zwiększoną ekspresją TGF-β jest związane z ustępowaniem stanu zapalnego i łagodnym uszkodzeniem płuc. W przeciwieństwie do tego przerwane gojenie się ran przez S-IgG skutkowało zmniejszeniem wytwarzania TGF-β i przedłużoną aktywacją klasycznych makrofagów oraz sprzyjało ciężkiemu uszkodzeniu płuc. Nasze odkrycia opierają się głównie na obrazowaniu utrwalonych w formalinie tkanek zainfekowanych makaków, co może mieć ograniczenia techniczne. Szczegółowa analiza cytometrii przepływowej byłaby pomocna w dalszej charakterystyce subpopulacji makrofagów w zakażonych płucach. Niestety,https://www.who.int/csr/sars/biosafety2003_04_25/en/ ). Powiedziawszy to, TGF-β pochodzi głównie z makrofagów gojących rany, ale nie z klasycznie aktywowanych makrofagów. Dlatego uważamy, że poprzez barwienie zarówno TGF-β, jak i CD206 (inny biomarker makrofagów gojących rany), stwierdzenie redukcji tego typu makrofagów w płucach leczonych S-IgG jest przekonujące.

Pacjenci, którzy otrzymywali osocze rekonwalescencyjne od pacjentów z SARS, którzy wyzdrowieli, mieli krótszy pobyt w szpitalu i niższy wskaźnik śmiertelności bez widocznych działań niepożądanych ( 45 –47 ). Wyniki te mogą odzwierciedlać różną jakość przeciwciał u pacjentów wyleczonych od pacjentów zmarłych podczas wczesnego zakażenia. Rzeczywiście, wcześniej zaobserwowaliśmy, że zmarli pacjenci mieli znacznie wyższe NAb z bardzo niskim poziomem przeciwciał anty-N w surowicy we wczesnym stadium infekcji (14 ). W przeciwieństwie do tego, wyzdrowieni pacjenci mieli szybszy rozwój przeciwciał anty-N i wolniejszy rozwój NAb (14 ). Konsekwentnie, surowica od zmarłych pacjentów — ale nie osób, które przeżyły SARS we wczesnych stadiach zakażenia — zwiększyła wytwarzanie IL-6, IL-8 i MCP1 przez makrofagi gojące rany ( Figura 8 ). Wcześniej zidentyfikowaliśmy epitopy w białku S, które wywoływały NAb i przeciwciała, które nasilały infekcję SARS-CoV (48 ,49 ). Dalsze badania, które będą próbować zidentyfikować przeciwciała i epitopy, które pośredniczą w zapobieganiu lub wzmacnianiu ALI, mogą być potrzebne do przyszłego projektowania szczepionek i immunoterapii.

Wreszcie blokada FcγR zmniejszyła produkcję prozapalnych cytokin, co sugeruje potencjalną rolę FcγR w postulowanym przeprogramowaniu alternatywnie aktywowanych makrofagów. FcγRs są funkcjonalnie podzielone na receptory aktywujące i hamujące. Aktywacja FcγRs, takich jak FcγRI, FcγRIIA i FcγRIII, wyzwala wytwarzanie prozapalnych chemokin i cytokin poprzez motyw aktywacji immunoreceptora tyrozyny (ITAM) w ich domenie intracytoplazmatycznej i kinazy z rodziny SRC oraz kinazę tyrozynową śledziony (SYK), podczas gdy hamujący FcγR , FcγRIIB, ma motyw hamowania oparty na immunoreceptorze tyrozyny (ITIM) w swojej domenie wewnątrzcytoplazmatycznej i przeciwdziała sygnałom, w których pośredniczy aktywacja FcγR. Na podstawie literatury i naszych eksperymentów,50 ). Dlatego jest prawdopodobne, że S-IgG promuje wytwarzanie prozapalnych cytokin poprzez FcγRI i/lub FcγRIIA. S-IgG nie wpływa na czynność makrofagów aktywowanych klasycznie in vitro. Tę różnicę można prawdopodobnie wyjaśnić wysokim wyjściowym poziomem cytokin prozapalnych przed infekcją i obniżoną ekspresją FcγR na klasycznie aktywowanym MDM przez leczenie SARS-CoV.

Metody

Szczepienia zwierząt. Zaszczepiliśmy chińskie makaki rezus, jak opisano wcześniej ( 51 ). W skrócie, 16 chińskich małp rezusów immunizowano dwukrotnie w dniach 0 i 28. Osiem z tych zwierząt otrzymało ADS-MVA, podczas gdy pozostałe 8 zwierząt otrzymało ADC-MVA. Wektory ADS-MVA i ADC-MVA kodujące białko SARS-CoV S lub E1E2 HCV zostały skonstruowane i wyprodukowane zgodnie z wcześniejszym opisem (51 ). Dawka dla obu immunizacjach wynosił 5 x 10 8 TCID 50 . Szczep szczepionkowy SARS-CoV HKU39849 (AY278491) wykazuje 100% homologię sekwencji genu S ze szczepem prowokacyjnym SARS-CoV PUMC (AY350750).

Zwierzęta, tkanki i zakażenie SARS-CoV. Wszystkie zwierzęta zakażone SARS-CoV i zwierzęta kontrolne były dorosłymi samicami chińskich makaków rezus. W sumie 42 chińskie makaki rezus poddano prowokacji żywym patogennym SARS-CoV (PUM, TCID 50 = 50), jak opisano wcześniej ( 25 ). Dodatkowe 3 niezainfekowane makaki zaszczepiono PBS jako kontrolę negatywną. Zwierzęta poddano codziennemu pomiarowi temperatury odbytu, rutynowym badaniom krwi i radiografii klatki piersiowej. Zwierzęta uśmiercono 2, 3, 7, 21 i 35 dni po zaszczepieniu ( ryc. 1 , ryc. 2 i ryc. 6). Wszystkie zwierzęta poddano humanitarnej eutanazji przez przedawkowanie dożylne pentobarbitalu i natychmiast poddano sekcji. Tkanki płuc (lewy i prawy płat czaszkowy, środkowy i ogonowy oraz prawy płat dodatkowy) zebrano i utrwalono w 10% formalinie buforowanej obojętnie, zatopiono w parafinie i pocięto na 5 μm.

Pasywny transfer IgG. Surowicę immunologiczną SARS-CoV S wytworzono przez szczepienie wektorami ADS-MVA. IgG oczyszczono z połączonych surowic za pomocą chromatografii powinowactwa białka G do czystości >95%. IgG zostało pozbawione pirogenów, zatężone do 20-30 mg białka ml- 1 i podane dożylnie. Biorcy otrzymali 200 mg lub 5 mg oczyszczonej IgG na kg masy ciała na 48 godzin przed prowokacją wirusową.

Neutralizacja. Opracowano test neutralizacji w celu określenia humoralnych odpowiedzi immunologicznych wywoływanych przez szczepionkę, jak opisano wcześniej ( 51 ). Aktywność neutralizującą inaktywowanych termicznie surowic zwierzęcych określono przy użyciu testu wnikania wirusa pseudotypowego. Wirus pseudotypowy wytworzono przez kotransfekcję komórek 293T z 2 plazmidami, pcDNA-Sop9 i pNL4-3Luc_Env_Vpr_, niosącymi odpowiednio zoptymalizowany gen S i szkielet ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1. Seryjnie rozcieńczone próbki surowicy inkubowano z równymi ilościami wirusa pseudotypu w 37°C przez 1 godzinę. Mieszaniny surowica-wirus dodano następnie do wstępnie wysianych komórek HEK 293T-ACE2. Po 56 godzinach zakażone komórki poddano lizie w celu zmierzenia aktywności lucyferazy.

Nested RT-PCR i izolacja SARS-CoV. Próbki wymazów z gardła pobrano od zakażonych małp pierwszego dnia po zaszczepieniu, a następnie zbadano pod kątem SARS-CoV przy użyciu zagnieżdżonej RT-PCR, jak opisano wcześniej ( 25). W skrócie, RNA wyizolowano przy użyciu TRIZOL (Invitrogen). RT-PCR przeprowadzono w objętości reakcji 50 μl z parą starterów zewnętrznych (5′-GCTGCATTGGTTTGTTATATCGTTA-TGC-3′) i (5′-ATACAGAATACAT-AGATTGCTGTTATCC-3′), parą starterów wewnętrznych (5′-TCACTTGCTTCCGTTGAGGTAGC-CAGCGTGGT- GGTTCATACAA-3′) i (5′-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCTCCCGG-CAGAAAGCTGTAAGCT-3′). Wszystkie produkty PCR zweryfikowano przez sekwencjonowanie nukleotydów. SARS-CoV wyizolowano jak opisano wcześniej. W skrócie, próbki wymazów z gardła zakażonych makaków zaszczepiono na komórkach Vero-E6 i hodowano w DMEM (Thermo Fisher Scientific). Do określenia statusu infekcji zwierząt zastosowano zarówno efekt cytopatyczny (CPE), jak i test immunofluorescencyjny (IFA) (inkubacja z rozcieńczeniem 1:10 surowicy pacjenta SARS).

Podwójne i potrójne barwienie immunofluorescencyjne na skrawkach parafinowych. Próbki odparafinowano i uwodniono. Po zablokowaniu normalną surowicą kozią przez 30 minut w temperaturze pokojowej, zastosowano królicze przeciwciało nukleokapsydowe anty-SARS-CoV (ss-006-0100, eENZYME) w temperaturze 4°C przez noc, a następnie kozie przeciwkrólicze skoniugowane z Alexa Fluor 448 Przeciwciało IgG przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadzono dodatkowe barwienie immunofluorescencyjne przez całonocną inkubację z przeciwciałami pierwszorzędowymi, a następnie detekcję sygnałów przy użyciu odpowiednich drugorzędowych przeciwciał fluorescencyjnych (MilliporeSigma) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

Pierwotne przeciwciała do barwienia immunofluorescencyjnego. W badaniu tym zastosowano następujące przeciwciała pierwszorzędowe: SARS-CoV NP (ss-006-0100, eENZYME); MAC387 (klon MAC387, AbD, Serotec); CD68 (klon KPI, DAKO; ab125047, Abcam); CD163 (klon EDHu1, AbD i ab183476, Abcam); HAM56 (klon HAM56, DAKO); CD206 (HPA004114, MilliporeSigma); TGF-p (sc-146, Santa Cruz Biotechnology Inc.); IL-6 (sc-1265, Santa Cruz Biotechnology Inc.); AE1/AE3 (klon AE1/AE3, DAKO).

Studia ISH.ISH został opracowany do wykrywania SARS-CoV. Fragmenty DNA białek N i S ze szczepu SARS-CoV z Hongkongu (AY278491) zastosowano jako matryce do wygenerowania sond RNA. Sondy znakowano digoksygeniną (GENEWIZ Inc.). Po odparafinowaniu i uwodnieniu, skrawki poddano działaniu mikrofal w domowej kuchence mikrofalowej o mocy 800 W (NN-ST556M, Panasonic) przy średniej mocy przez 10 minut w 0,01 M buforze cytrynianu sodu. Hybrydyzację przeprowadzono w bardzo rygorystycznych warunkach z 150 ng/ml zdenaturowanej sondy w 45°C przez 16 godzin w 50 μl mieszanki hybrydyzacyjnej (50% formamid, 10% siarczan dekstranu w 2x soli fizjologicznej cytrynianu sodu [SSC]) w wilgotnej komorze . Nadmiar sondy usunięto przez dwukrotne przemycie 2x SSC przez 20 minut w 45°C, a następnie 2 przemycie w 1x SSC i 0,1x SSC przez 20 minut w 45°C. Detekcję immunologiczną przeprowadzono przy użyciu zestawu DIG Nuclear Acid Detection Kit (Roche Diagnostics) zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, po inkubacji z 1% odczynnikiem blokującym przez 30 minut, skrawki inkubowano z koniugatem owczej anty-digoksygeniny z alkaliczną fosfatazą (11093274910, Roche Diagnostics) rozcieńczonym 1:500 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po 3 oddzielnych płukaniach buforem do płukania (0,1 M kwas maleinowy, 0,15 M NaCl [pH 7,5], 0,3% Tween 20), sygnał został opracowany przy użyciu 200 μl mieszaniny HNPP/Fast Red TR (1758888, Roche Diagnostics) w ciemno przez 45 minut. Sekcje zostały wybarwione kontrastowo za pomocą DAPI. Jako kontrolę negatywną zastosowano skrawki tkanek inkubowane z sondą sensowną RNA. po inkubacji z 1% odczynnikiem blokującym przez 30 minut, skrawki inkubowano z koniugatem owczej anty-digoksygeniny z alkaliczną fosfatazą (11093274910, Roche Diagnostics) rozcieńczonym 1:500 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po 3 oddzielnych płukaniach buforem do płukania (0,1 M kwas maleinowy, 0,15 M NaCl [pH 7,5], 0,3% Tween 20), sygnał został opracowany przy użyciu 200 μl mieszaniny HNPP/Fast Red TR (1758888, Roche Diagnostics) w ciemno przez 45 minut. Sekcje zostały wybarwione kontrastowo za pomocą DAPI. Jako kontrolę negatywną zastosowano skrawki tkanek inkubowane z sondą sensowną RNA. po inkubacji z 1% odczynnikiem blokującym przez 30 minut, skrawki inkubowano z koniugatem owczej anty-digoksygeniny z alkaliczną fosfatazą (11093274910, Roche Diagnostics) rozcieńczonym 1:500 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po 3 oddzielnych płukaniach buforem do płukania (0,1 M kwas maleinowy, 0,15 M NaCl [pH 7,5], 0,3% Tween 20), sygnał został opracowany przy użyciu 200 μl mieszaniny HNPP/Fast Red TR (1758888, Roche Diagnostics) w ciemno przez 45 minut. Sekcje zostały wybarwione kontrastowo za pomocą DAPI. Jako kontrolę negatywną zastosowano skrawki tkanek inkubowane z sondą sensowną RNA. 15 M NaCl [pH 7,5], 0,3% Tween 20), sygnał rozwijano przy użyciu 200 μl mieszaniny HNPP/Fast Red TR (1758888, Roche Diagnostics) w ciemności przez 45 minut. Sekcje zostały wybarwione kontrastowo za pomocą DAPI. Jako kontrolę negatywną zastosowano skrawki tkanek inkubowane z sondą sensowną RNA. 15 M NaCl [pH 7,5], 0,3% Tween 20), sygnał rozwijano przy użyciu 200 μl mieszaniny HNPP/Fast Red TR (1758888, Roche Diagnostics) w ciemności przez 45 minut. Sekcje zostały wybarwione kontrastowo za pomocą DAPI. Jako kontrolę negatywną zastosowano skrawki tkanek inkubowane z sondą sensowną RNA.

Mikroskopia konfokalna. Mikroskopię konfokalną wykonano przy użyciu mikroskopu konfokalnego Carl Zeiss LSM 700 wyposażonego w 4 lasery (Zeiss). ZEN (Zeiss) zastosowano do przypisania kolorów do 4 zebranych kanałów: Alexa Fluor 568 i HNPP/Fast Red, który fluoryzuje po ekspozycji na laser o długości fali 568 nm i wydaje się czerwony; Alexa Fluor 488 (Molecular Probes), który wydaje się zielony; Alexa Fluor 647 (Molecular Probes), który wygląda na niebieskozielony; oraz obraz kontrastu interferencji różnicowej (DIC), który jest w skali szarości. Zebrano jednocześnie 4 kanały. W celu rozróżnienia pomiędzy poszczególnymi komórkami, Hoechst 33258 (marker jądrowy; Molecular Probes) zastosowano przy 1 μg/ml i inkubowano przez 5 minut, a następnie spłukano wodą. Kolokalizacja antygenów została wykazana przez dodanie kolorów, jak wskazano w legendzie figury.

Izolacja monocytów, różnicowanie i polaryzacja makrofagów. Monocyty oczyszczono z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej uzyskanych z kożuszków leukocytarno-płytkowych krwi (dostarczonych przez Czerwony Krzyż, Hongkong, Chiny) lub małpiej krwi obwodowej, jak opisaliśmy wcześniej ( 52).). Krew obwodową małpy pobrano w heparynizowanych probówkach vacutainer od zdrowych samic małp rezus. W celu wytworzenia makrofagów M1, monocyty różnicowano w pożywce RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) uzupełnionej GM-CSF (400 IU/ml), 2 mM glutaminą, 10% FCS bez dopełniacza, 100 IU/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (Thermo Fisher Scientific) przez 4 dni, a następnie ekspozycja na świeżą pożywkę uzupełnioną 5% FCS i zawierającą GM-CSF i LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (20 ng/ml) przez dodatkowe 72 godziny. Aby wytworzyć makrofagi M2, monocyty różnicowano w pożywce RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) uzupełnionej M-CSF (50 ng/ml), 2 mM glutaminą, 10% pozbawioną dopełniacza FCS, 100 IU/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny przez 4 dni,

Ilościowa ocena poziomu cytokin.Panel 13 cytokin, w tym IL-1β, IFN-α, IFN-γ, TNF-α, MCP1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-18, IL -23 i IL-33 w surowicy małp iw pożywce hodowlanej oznaczono ilościowo przy użyciu technologii multipleksujących kulek laserowych (BioLegend). Aby ocenić wytwarzanie cytokin przez makrofagi, komórki spolaryzowane in vitro przemyto 3 razy PBS, a następnie aktywowano pseudotypowym wirusem SARS-CoV w pożywce RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) z lub bez podawania silnie rozcieńczonego i inaktywowanego termicznie ( 56°C) surowice od makaków lub pacjentów z SARS. FcγR-specyficzne mysie przeciwciało monoklonalne (5 μg, klon 3G8, anty-hCD16, 16016682; klon FLI8.26, anty-hCD32, 16032981; i klon 10.1, anty-hCD64, 16064981 [BD Pharmingen]) zastosowano do blokady ludzkiego FcγR. Supernatant z tych hodowli odzyskano po 20 godzinach stymulacji,

Statystyka. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono stosując dwustronny test t- Studenta. Za statystycznie istotne uznano wartości p mniejsze niż 0,05. Dane przedstawiono jako wartości średnie ± SEM z co najmniej 3 niezależnych eksperymentów, o ile nie wskazano inaczej.

Zatwierdzenie badania. Eksperyment przeprowadzono w obiekcie dla zwierząt o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3. Procedury postępowania i eksperymentalne, w tym zastrzyki, pobieranie krwi, prowokacja wirusem i poświęcanie, zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z komisją ds. dobrostanu zwierząt ds. Wykorzystania żywych zwierząt w nauczaniu i badaniach Instytutu Nauki o Zwierzętach Laboratoryjnych w Pekinie, Chiny. Wszyscy uczestnicy badania udzielili świadomej zgody, a procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komisję Etyki Badawczej Uniwersytetu Hongkongu.

Autorskie Wkłady

ZC, LL i QW zaprojektowali badanie. LL i QW przeanalizowali dane. LL, ZC, KYY, SP i AL przyczynili się do napisania rękopisu. ZC jest głównym badaczem, odpowiedzialnym za projekt badania. QW i CQ koordynowały organizację autopsji i gromadzenie materiałów z autopsji makaków chińskich. QW był zaangażowany w rozwój i wykonanie testu RT-PCR. LL, HT, TW i KWC wykonały test neutralizacji. LL, XA i AL były zaangażowane w opracowanie testów H&E, SARS-CoV IHC i ISH. HW przeprowadził test ISH i barwienie IHC NP oraz obliczył średnią intensywność fluorescencji w płucach. LL, HK i KN wykonały barwienie H&E i podwójne lub potrójne IHC. JF i HT przeprowadzili hodowlę makrofagów pochodzących z monocytów. QL, HT, JP, a ZT przeprowadził analizę produkcji cytokin w supernatancie hodowli komórkowej i surowicach małpich. KHC i KYY koordynowały pobieranie próbek surowicy i tkanek od pacjentów z SARS. Wszyscy autorzy byli zaangażowani w korelacyjną interpretację danych patologicznych i molekularnych.

Materiał uzupełniający

Podziękowanie

Praca ta była wspierana finansowo z grantów US NIH RO1HL080211 i Hong Kong Research Grants Council TRS T11-706/18-N dla ZC, TNPRC (grant bazowy RR00164), RO1060699 dla SP, HMRF16150662 oraz University Development Fund/Li Ka Shing Faculty of Medicine Matching Fund Uniwersytetu w Hongkongu do jego Instytutu AIDS i Hongkongu RGV. Autorzy pragną podziękować DD Ho i K. Liu za wsparcie i porady naukowe oraz Wenjie Yu za pomoc w oczyszczaniu S-IgG i C-IgG.

Przypisy

Konflikt interesów: Praca ta była wspierana finansowo przez granty z US NIH RO1HL080211 i HK RGC TRS T11-706/18-N dla ZC, TNPRC (grant podstawowy RR00164), RO1060699 dla SP, HMRF 16150662 oraz University Development Fund /Li Ka Shing Wydział Medycyny Dopasowania Funduszu Uniwersytetu w Hongkongu do jego Instytutu AIDS i Hongkongu RGV.

Licencja: Copyright 2019, Amerykańskie Towarzystwo Badań Klinicznych.

Informacje referencyjne: Wgląd JCI . 2019;4(4):e123158. https://doi.org/10.1172/jci.insight.123158.

Bibliografia

Drosten C, et al. Identyfikacja nowego koronawirusa u pacjentów z ciężkim zespołem ostrej niewydolności oddechowej. N Engl J Med . 2003;348(20):1967-1976.

Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google ScholarKsiążek TG, et al. Nowy koronawirus związany z ciężkim zespołem ostrej niewydolności oddechowej. N Engl J Med . 2003;348(20):1953-1966.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Hwang DM, Chamberlain DW, Poutanen SM, Low DE, Asa SL, Butany J. Patologia płuc ciężkiego ostrego zespołu oddechowego w Toronto. Mod Pathol . 2005;18(1):1-10.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Peiris JS, Guan Y. Konfrontacja z SARS: widok z Hongkongu. Philos Trans R Soc Lond, B, Biol Sci . 2004;359(1447):1075-1079.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Nicholls J, Dong XP, Jiang G, Peiris M. SARS: wirusologia kliniczna i patogeneza. Respirologia . 2003;8 Suplement:S6–S8.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed Google ScholarPeiris JS i in. Progresja kliniczna i miano wirusa w epidemii zapalenia płuc SARS związanego z koronawirusem: badanie prospektywne. Lancet . 2003;361(9371):1767-1772.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Ware LB, Matthay MA. Zespół ostrej niewydolności oddechowej. N Engl J Med . 2000;342(18):1334–1349.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Herold S, Mayer K, Lohmeyer J. Ostre uszkodzenie płuc: jak makrofagi kierują rozwiązywaniem stanu zapalnego i naprawą tkanek. Przód Immunol . 2011; 2:65.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed Google Scholar
Murray PJ, Wynn TA. Ochronne i patogenne funkcje podzbiorów makrofagów. Nat Rev Immunol . 2011;11(11):723-737.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Mosser DM, Edwards JP. Badanie pełnego spektrum aktywacji makrofagów. Nat Rev Immunol . 2008;8(12):958-969.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Wynn TA, Vannella KM. Makrofagi w naprawie, regeneracji i zwłóknieniu tkanek. Odporność . 2016;44(3):450–462.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Perlman S, Dandekar AA. Immunopatogeneza zakażeń koronawirusem: implikacje dla SARS. Nat Rev Immunol . 2005;5(12):917–927.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Channappanavar R, et al. Rozregulowany interferon typu I i reakcje zapalne monocytów-makrofagów powodują śmiertelne zapalenie płuc u myszy zakażonych SARS-CoV. Mikrob komórki gospodarza . 2016;19(2):181–193.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Zhang L, et al. Odpowiedzi przeciwciał przeciwko koronawirusowi SARS są skorelowane z przebiegiem choroby u zakażonych osób. J Med Virol . 2006;78(1):1-8.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Do KK i in. Wysokie miano i awidność nieneutralizujących przeciwciał przeciwko antygenowi szczepionki przeciw grypie są związane z ciężką grypą. Clin Szczepionka Immunol . 2012;19(7):1012–1018.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Monsalvo AC i in. Ciężka pandemiczna grypa H1N1 2009 spowodowana patogennymi kompleksami immunologicznymi. Nat Med . 2011;17(2):195-199.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Glina C, et al. Pierwotne zakażenie koronawirusem zespołu ostrej ostrej niewydolności oddechowej ogranicza replikację, ale nie zapalenie płuc po ponownym homologicznym prowokacji. J Virol . 2012;86(8):4234–4244.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Bolles M i in. Podwójnie inaktywowana szczepionka koronawirusowa z ciężkim ostrym zespołem oddechowym zapewnia niepełną ochronę u myszy i indukuje zwiększoną eozynofilową prozapalną odpowiedź płuc po prowokacji. J Virol . 2011;85(23):12201–12215.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Tseng CT i in. Immunizacja szczepionkami przeciwko koronawirusowi SARS prowadzi do immunopatologii płuc po prowokacji wirusem SARS. PLo 1 . 2012;7(4):e35421.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Zhao J, et al. Komórki T CD4(+) pamięci dróg oddechowych pośredniczą w odporności ochronnej przed pojawiającymi się koronawirusami układu oddechowego. Odporność . 2016;44(6):1379–1391.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Channappanavar R, Fett C, Zhao J, Meyerholz DK, Perlman S. Specyficzne wobec wirusa limfocyty T CD8 pamięci zapewniają znaczną ochronę przed śmiertelnym ciężkim zakażeniem koronawirusem zespołu ostrego układu oddechowego. J Virol . 2014;88(19):11034–11044.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Odpowiedzi komórek Zhao J, Zhao J, Perlman S. T są wymagane do ochrony przed chorobą kliniczną i usuwania wirusa u myszy zakażonych koronawirusem z ciężkim zespołem ostrego układu oddechowego. J Virol . 2010;84(18):9318–9325.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Honda-Okubo Y, Barnard D, Ong CH, Peng BH, Tseng CT, Petrovsky N. Szczepionki koronawirusowe związane z ciężkim zespołem ostrej niewydolności oddechowej sformułowane z adiuwantami delta inuliny zapewniają zwiększoną ochronę przy jednoczesnej poprawie immunopatologii eozynofilowej płuc. J Virol . 2015;89(6):2995–3007.

Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Chen Z i in. Rekombinowany zmodyfikowany wirus krowianki Ankara, w którym zachodzi ekspresja glikoproteiny szczytowej koronawirusa zespołu ostrej niewydolności oddechowej, indukuje ochronne przeciwciała neutralizujące, których celem jest przede wszystkim region wiążący receptor. J Virol . 2005;79(5):2678–2688.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Liu L i in. Współdziałanie czasoprzestrzenne koronawirusa ciężkiego ostrego zespołu oddechowego i komórek błony śluzowej układu oddechowego prowadzi do rozprzestrzeniania się wirusa u makaków rezus. Immunol śluzówkowy . 2016;9(4):1089-1101
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Li BJ i in. Wykorzystanie siRNA w profilaktyce i leczeniu koronawirusa SARS u makaków Rhesus. Nat Med . 2005;11(9):944-951
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Qin C, et al. Model zwierzęcy SARS wytworzony przez zakażenie Macaca mulatta koronawirusem SARS. J Pathol . 2005;206(3):251–259.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Soulas C, et al. Ostatnio infiltrując monocyty/makrofagi MAC387(+) trzecia populacja makrofagów zaangażowana w tworzenie zmian encefalicznych SIV i HIV. Jestem J Patholem . 2011;178(5):2121-2135.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Cai Y, Sugimoto C, Arainga M, Alvarez X, Didier ES, Kuroda MJ. Charakterystyka makrofagów pęcherzykowych i śródmiąższowych płuc u makaków rezus in vivo: implikacje dla zrozumienia chorób płuc u ludzi. J Immunol . 2014;192(6):2821–2829.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Murray PJ i in. Aktywacja i polaryzacja makrofagów: nazewnictwo i wytyczne eksperymentalne. Odporność . 2014;41(1):14-20.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Imai Y, et al. Identyfikacja stresu oksydacyjnego i sygnalizacji receptora Toll-podobnego 4 jako kluczowego szlaku ostrego uszkodzenia płuc. Komórka . 2008;133(2):235–249.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Atreya R, et al. Blokada sygnalizacji interleukiny 6 trans hamuje odporność komórek T na apoptozę w przewlekłym zapaleniu jelit: dowody w chorobie Crohna i doświadczalnym zapaleniu okrężnicy in vivo. Nat Med . 2000;6(5):583-588.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Braciale TJ, Sun J, Kim TS. Regulowanie adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej na infekcję wirusową układu oddechowego. Nat Rev Immunol . 2012;12(4):295-305.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Subbarao K, et al. Wcześniejsza infekcja i bierny transfer przeciwciała neutralizującego zapobiega replikacji koronawirusa zespołu ostrej niewydolności oddechowej w drogach oddechowych myszy. J Virol . 2004;78(7):3572–3577.

Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Yang ZY i in. Szczepionka DNA indukuje neutralizację koronawirusa SARS i odporność ochronną u myszy. Natura . 2004;428(6982):561–564.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Du L i in. Przygotowanie za pomocą rAAV kodującego RBD białka SARS-CoV S i wzmocnienie peptydami specyficznymi dla RBD dla epitopów komórek T zwiększyło humoralną i komórkową odpowiedź immunologiczną przeciwko infekcji SARS-CoV. Szczepionka . 2008;26(13):1644-1651.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Du L i in. Donosowe szczepienie rekombinowanym wirusem związanym z adenowirusem kodującym domenę wiążącą receptor białka szczytowego ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV) indukuje silną odpowiedź immunologiczną śluzówki i zapewnia długotrwałą ochronę przed zakażeniem SARS-CoV. J Immunol . 2008;180(2):948-956.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Du L i in. Domena wiążąca receptor białka szczytowego SARS-CoV indukuje długotrwałą odporność ochronną w modelu zwierzęcym. Szczepionka . 2007;25(15):2832–2838.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Fett C, DeDiego ML, Regla-Nava JA, Enjuanes L, Perlman S. Całkowita ochrona przed śmiertelną chorobą układu oddechowego, w której pośredniczy koronawirus, u starszych myszy przez immunizację wirusem przystosowanym do myszy bez białka E. J Virol . 2013;87(12):6551–6559.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Iwata-Yoshikawa N, et al. Wpływ stymulacji receptora Toll-podobnego na naciek eozynofilowy w płucach myszy BALB/c immunizowanych inaktywowaną UV szczepionką koronawirusową związaną z ciężkim ostrym zespołem oddechowym. J Virol . 2014;88(15):8597–8614.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Qin E, et al. Immunogenność i skuteczność ochronna u małp oczyszczonej inaktywowanej szczepionki Vero-cell SARS. Szczepionka . 2006;24(7):1028–1034.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Zhou J, et al. Immunogenność, bezpieczeństwo i skuteczność ochronna inaktywowanej szczepionki koronawirusowej związanej z SARS u małp rezus. Szczepionka . 2005;23(24):3202–3209.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Openshaw PJ, Tregoning JS. Odpowiedzi immunologiczne i nasilenie choroby podczas infekcji wirusem syncytium nabłonka oddechowego. Clin Microbiol Rev . 2005;18(3):541–555.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Stockman LJ i in. Ciężki zespół ostrej niewydolności oddechowej u dzieci. Pediatr Infect Dis J . 2007;26(1):68-74.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Mair-Jenkins J, et al. Skuteczność osocza rekonwalescencyjnego i immunoglobuliny hiperimmunologicznej w leczeniu ciężkich ostrych infekcji dróg oddechowych o etiologii wirusowej: przegląd systematyczny i metaanaliza eksploracyjna. J Zainfekuj Dis . 2015;211(1):80–90.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Cheng Y i in. Zastosowanie terapii osoczem rekonwalescencyjnym u pacjentów z SARS w Hongkongu. Eur J Clin Microbiol Infect Dis . 2005;24(1):44–46.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Tak więc YO, et al. Retrospektywne porównanie osocza rekonwalescencyjnego z kontynuacją leczenia dużymi dawkami metyloprednizolonu u pacjentów z SARS. Zakażenie mikrobiolem Clin . 2004;10(7):676-678.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Wang Q i in. Immunodominujące epitopy koronawirusa SARS u ludzi wywoływały zarówno wzmacniający, jak i neutralizujący wpływ na infekcję u naczelnych innych niż ludzie. ACS Infect Dis . 2016;2(5):361–376.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Yi CE, Ba L, Zhang L, Ho DD, Chen Z. Pojedyncze podstawienia aminokwasów w glikoproteinie kolca koronawirusa zespołu ostrej niewydolności oddechowej określają wejście wirusa i immunogenność głównej domeny neutralizującej. J Virol . 2005;79(18)::11638-11646.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Pahl JH i in. Makrofagi hamują wzrost komórek ludzkiego kostniakomięsaka po aktywacji za pomocą liposomalnego tripeptydu muramylowego pochodnego ściany komórkowej bakterii w połączeniu z interferonem-γ. J Exp Clin Cancer Res . 2014;33:27.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed Google Scholar
Kieran J, et al. Względna skuteczność boceprewiru i telaprewiru w leczeniu wirusa zapalenia wątroby typu C o genotypie 1. Clin Infect Dis . 2013;56(2):228-235.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
Cheng L, et al. Przeciwciała monoklonalne specyficzne dla ludzkiego Δ42PD1: nowy immunoregulator potencjalnie zaangażowany w patogenezę HIV-1 i nowotworu. MAbs . 2015;7(3):620–629.
Zobacz ten artykuł przez: PubMed CrossRef Google Scholar
0.00 avg. rating (0% score) - 0 votes
CZERWONE

Wyraź swoją opinię ! TO WAŻNE !!

Witryna wykorzystuje Akismet, aby ograniczyć spam. Dowiedz się więcej jak przetwarzane są dane komentarzy.

ODBLOKUJ TREŚCI I STREAM KLIKAJĄC W PONIŻSZY OBRAZEK PEŁNA INSTRUKCJA  + MATERIAŁ FILMOWY !! 

Holler Box

KORZYSTASZ Z OGRANICZONEGO CZASOWO DOSTĘPU !!

DALSZE KORZYSTANIE ZE STRONY MOŻLIWE PO URUCHOMIENIU DOSTĘPU PREMIUM 

 

STREAM PONIEDZIAŁEK , WTOREK, ŚRODA , CZWARTEK 21.00 - SOBOTA 20.00

ABY TA BLOKADA STRONY BYŁA DLA CIEBIE NIE WIDOCZNA ZAŁÓŻ KONTO I ZALOGUJ SIĘ INSTR. FILMOWA PONIŻEJ :-)

ODBLOKUJ TREŚCI I STREAM KLIKAJĄC W PONIŻSZY OBRAZEK PEŁNA INSTRUKCJA  + MATERIAŁ FILMOWY !! 

Holler Box
%d bloggers like this: