NAJCZĘŚCIEJ CZYTANE
Przeczytaj koniecznie!Dr.G.Vanden Bossche ostrzega wszystkie kraje przed masowymi szczepieniami.
Skandal w Niemczech !!  Uniwersytet w Ulm przebadał szczepionki..
RAPORT COVIDOWY - TRAGEDIA NARODU POLSKIEGO - Paweł Klimczewski  ekspert analizy danych spolecznych i demograficznych, PSNLiN
Lekarz przerywa milczenie: poważne skutki uboczne, dzieci i osoby starsze zagrożone
   POLITYKA STRONY M-FORUM !!! - WSZYSTKIE ZAMIESZCZANE MATERIAŁY ORAZ PREZENTOWANE I PROPAGOWANE - Poglądy i opinie zawarte w artykułach mogą być niezgodne ze stanowiskiem redakcji. !!!! REDAKCJA M-FORUM AV LIVE MA NA CELU PUBLIKOWANIE WSZYSTKICH INFORMACJI KTÓRE SĄ CENZUROWANE BEZ WZGLĘDU NA ZABARWIENIA POLITYCZNE , RELIGIJNE I OBYCZAJOWE - ZA KOMENTARZE I WYPOWIEDZI CZYTELNIKÓW I WIDZÓW NIE BIERZE ODPOWIEDZIALNOŚCI , Z WYJĄTKIEM TREŚCI O CHARAKTERZE PRZESTĘPCZYM KTÓRE BĘDĄ USUWANE BEZ OSTRZEŻEŃ     UWAGA !! WAŻNE - Poglądy i opinie zawarte w artykule mogą być niezgodne ze stanowiskiem redakcji. Zamieszczane artykułu są w wiekszości re- publikacjami materiałów z innych stron - REDAKCJA NIE INGERUJE W ICH TREŚCI W CELU ZACHOWANIA BEZSTRONNOŚCI , A CELEM PUBLIKACJI JEST PODDANIE TYCH MATERIAŁÓW POD OSĄD I KRYTYKĘ CZYTELNIKÓW W KTÓRE OPINIE NIE MOŻE INGEROWAĆ AUTOR MATERIAŁU W FORMIE MODERACJI LUB CENZURY

M-forum A.V Live.

TO PORTAL NA KTÓRYM CODZIENNIE ZNAJDZIESZ PONAD 100 INFORMACJI INFO NIUS W TYM MATERIAŁY CENZUROWANE LUB ZABRONIONE NA INNYCH PORTALACH POPRAWNYCH POOLITYCZNIE

CZERWONE

Coo wykazała seria sekcji zwłok COVID-19 z badaniami klinicznymi?

The following two tabs change content below.

Gabi

Witam, nazywam się Gabriela Nowak, pracuję jako asystentka  zarządzania i obsługi Klienta w Kancelarii Prawnej,  niedawno w kwietniu 2019 r zostałam Przewodnicząca Komisji Skrutacyjnej w Radzie Miasta - gdzie czynnie reprezentuję interesy mieszkańców, którzy mi zaufali i mnie wybrali ! STOP CENZURZE   UWAŻASZ, ŻE CENZURA - ŁAMIE TWOJE PRAWA RP ?  WESPRZYJ MNIE - W TYM CO ROBIĘ - ♛  z dopiskiem - DAROWIZNA  ! Nest Bank Polska 75187010452078115029220001  Nest Bank zagranica IBAN PL75187010452078115029220001  Kod SWIFT Nest Bank: NESBPLPW   Dziękuję, $$$ Pozdrawiam i zapraszam do komentowania !   ♡♡♡ ZOBACZ TAKŻE POMAGAM ♡♡♡  https://zrzutka.pl/gc97mb

Seria sekcji zwłok COVID-19 z badaniami klinicznymi i patologicznymi porównaniami do grypy sezonowej i pandemicznej 

Sekcje zwłok pacjentów, którzy zmarli z powodu COVID-19, miały kluczowe znaczenie dla określenia wzorców urazów związanych z zakażeniem SARS-CoV-2. Pomimo ich użyteczności, obszernym badaniom autopsji brakuje nieco w stosunku do globalnego obciążenia chorobami, a bardzo niewiele obszernych badań kontekstualizuje wyniki dla innych śmiertelnych infekcji wirusowych. Opracowaliśmy nowy protokół sekcji zwłok w celu przeprowadzenia sekcji zwłok na ofiarach COVID-19 i tutaj opisujemy szczegółowe informacje kliniczne, ogólne wyniki i cechy histologiczne zaobserwowane podczas pierwszych 16 pełnych sekcji zwłok COVID-19. Oceniliśmy również krytycznie rolę badań pomocniczych stosowanych do ustalenia diagnozy COVID-19 podczas sekcji zwłok, w tym immunohistochemii (IHC), in situ.hybrydyzacja (ISH) i mikroskopia elektronowa (EM). IHC i ISH celujące w SARS-CoV-2 były porównywalne pod względem lokalizacji i liczby zakażonych komórek w tkance płucnej; jednakże niespecyficzne wybarwienie bakterii było sporadycznie obserwowane w przypadku IHC. EM nie ujawniał się w ślepo pobranych tkankach. Następnie porównaliśmy kliniczne i histologiczne cechy obecne w tej serii z sześcioma archiwalnymi przypadkami śmiertelnej grypy sezonowej i sześcioma archiwalnymi przypadkami grypy pandemicznej z czwartej fali „grypy hiszpańskiej” zimą 1920 r. Oprócz rutynowej histologii, badanie nacieki zapalne w płucach ofiar COVID-19 i grypy sezonowej porównano za pomocą ilościowego IHC. Nasze wyniki pokazują, że kliniczne i histologiczne cechy COVID-19 są podobne do tych obserwowanych w śmiertelnych przypadkach grypy, a te dwie choroby mają tendencję do nakładania się histologicznie. Nie stwierdzono istotnej różnicy w składzie nacieku zapalnego w COVID-19 i grypie w miejscach ostrego uszkodzenia płuc w czasie sekcji zwłok. Nasze badanie podkreśla stosunkowo niespecyficzne cechy kliniczne i zmiany patologiczne wspólne dla ciężkich przypadków COVID-19 i grypy, zapewniając jednocześnie ważne zastrzeżenia dotyczące pomocniczych metod wykrywania wirusów.

Wprowadzenie

Choroba wywoływana przez nowy wariant koronawirusa SARS (znanego jako COVID-19) nadal stanowi globalny stan zagrożenia zdrowia z ponad 109 000 000 potwierdzonych zakażeń [ 1 ]. W chwili sporządzania niniejszego raportu w samych Stanach Zjednoczonych odnotowano ponad 27 000 000 potwierdzonych przypadków i ponad 500 000 zgonów [ 2 ]. Jak COVID-19 jest chorobą zakaźną o wysokiej zdolności przenoszenia, autopsji u pacjentów pozytywnych wymaga specjalnych środków ostrożności [ 3 – 5 ], a istnieje wiele opisów przypadków i autopsji seria wyszczególnieniem patologiczne wyniki całym szeregu instytucji [ 3 – 24 ]. Podczas tych procedur są często ogranicza się do układu sercowo-naczyniowego i płucnego badania [ 6 – 10 ,25 ], wiele powstających raportów są kompleksowe i obejmują analizę wielu narządów [ 11 – 24 ]. Głównym miejscem zranienia COVID-19, płuca i ustalenia płuc obejmują wiele niespecyficznych wyników, takie jak obrzęk, przewlekłe zapalenie błony szklistej, ostre wobec organizujące rozproszone uszkodzenie pęcherzyków (DAD) i nałożoną odoskrzelowe [ 4 – 10 ] . Istnieją rzadkie doniesienia o zajęciu serca, w tym eozynofilowym zapaleniu mięśnia sercowego [21], ale większość opisywanych zmian sercowo-naczyniowych jest minimalna i niespecyficzna [ 8 , 12 , 24 , 25]]. Powikłania zakrzepowe coraz opisane jako potencjalne wyjątkowych aspektów COVID-19 [ 26 – 28 ], ale rozsiane krzepnięcie w wyniku infekcji wirusowych dobrze opisane zjawisko które obserwowano po wielu poważnych infekcji wirusowych, [ 29 ]. Doniesienia o objawach pozapłucnych z sekcji zwłok, w tym nerek [ 13 , 14 ], śledziony [ 18 ] i wątroby [ 19], pojawiają się również w literaturze. Badanie narządów poza płucami było w dużej mierze kierowane objawami klinicznymi w ciężkich zakażeniach (takich jak podwyższenie wyników testów czynnościowych wątroby i niewydolność nerek), ale znaczenie doniesień dotyczących tych narządów pozostaje w dużej mierze niepewne, biorąc pod uwagę ogólny niespecyficzny charakter wyników i brak porównania z innymi infekcjami wirusowymi.

W tym artykule opisujemy nowy protokół autopsji używany do przeprowadzania kompleksowych sekcji zwłok pacjentów z COVID-19 i zgłaszania pierwszych 16 sekcji zwłok. Opisano skumulowane zmiany patologiczne zidentyfikowane w płucach, sercu, wątrobie, śledzionie, nerkach, węzłach chłonnych, mięśniach i nerwach obwodowych. Ponadto krytycznie oceniamy rolę pomocniczych metod wykrywania wirusów, w tym immunohistochemii (IHC), chromogennych in situhybrydyzacja (ISH) i mikroskopia elektronowa (EM). Aby zapewnić bardziej odpowiedni kontekst dla zmian patologicznych odnotowanych w tych przypadkach i ocenić istotne różnice w porównaniu z innymi śmiertelnymi infekcjami wirusowymi, przeprowadziliśmy również bezpośrednie porównania naszych przypadków COVID-19 z archiwalnymi przypadkami śmiertelnego zakażenia grypą, aby uwzględnić oba przypadki: szczepy sezonowe (od 2015 do 2018 roku) i archiwalne przypadki grypy pandemicznej podczas czwartej fali „ hiszpańskiej grypy ” zimą 1920 r.

Metody

Opracowanie protokołu i procedura sekcji zwłok

Opracowaliśmy zmodyfikowany protokół sekcji zwłok (patrz materiał uzupełniający, Plik S1) w celu zapewnienia ochrony przed przypadkowym przeniesieniem COVID-19 oraz usprawnienia procedury autopsji, tak aby czas ekspozycji był ograniczony. Wszystkie uwzględnione przypadki zostały zatwierdzone do sekcji zwłok przez odpowiedniego przedstawiciela (przedstawicieli) pacjentów. Wszystkie przeprowadzone tutaj badania zostały zatwierdzone przez IRB w naszej instytucji jako protokół „Badania nad zmarłymi”. Wykorzystaliśmy zespół trzech do czterech osób, które miały doświadczenie w sekcji zwłok i były przeszkolone w zakresie naszego protokołu pojawiających się chorób zakaźnych (AlS, PP, JM, PM, HS i JV). Zespół został zorganizowany w następujący sposób: przy usuwaniu narządów pracowało od jednego do dwóch prosektorów; inny prosektor zważył, wyczyścił i pociął narządy; a ostatni prosektor zrobił zdjęcia, odnotował wyniki i udokumentował wagi. Wszystkie zasady zostały sprawdzone i zatwierdzone przez kontrolę zakażeń naszej instytucji.3 – 6 ].

Pobrane próbki obejmowały tchawicę, płuca, serce, wątrobę, śledzionę, splot lędźwiowy (nerw obwodowy), mięśnie szkieletowe (lędźwiowe), węzły chłonne i nerki. W każdym przypadku pobrano również próbki z przypadkowych patologii odkrytych podczas sekcji zwłok. W niektórych przypadkach biopsje jamy nosowo-gardłowej wykonywano za pomocą igły do ​​biopsji nakłuwającej. Tylko 1 z 16 przypadków był ograniczony do serca i płuc. Żaden z pacjentów nie został poddany ocenie mózgu ani rdzenia kręgowego ze względu na ryzyko pojawienia się aerozolowych cząstek generowanych przez piłę. Wszystkie zachowane narządy zostały natychmiast utrwalone w formalinie przez> 72 godziny przed cięciem histologicznym. Sekcje histologiczne obejmowały: Obwodowe, środkowe i wnękowe odcinki płuc dla każdego płata z obu płuc; wierzchołki / podstawy mięśnia sercowego z każdej komory i przegrody międzykomorowej; reprezentatywna kora, rdzeń, i miednicę z każdej nerki; reprezentatywne skrawki każdego płata wątroby i śledziony; sekcje zawierające jakiekolwiek węzły chłonne; oraz fragment wszelkich dodatkowych patologii wykrytych podczas sekcji zwłok. Wybrane badania immunohistochemiczne przeprowadzono przy użyciu zautomatyzowanych instrumentów Leica (Wetzlar, Niemcy) na Wydziale Patologii w University of Chicago Medical Center.

Walidacja i ocena przydatności pomocniczych metod wykrywania wirusów

W naszej serii przetestowano trzy metody identyfikacji wirusów. IHC nakierowane na nukleokapsyd wirusa przeprowadzono przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego produkowanego przez Thermo-Fisher Scientific (nr kat. MA1-7404; Waltham, MA, USA). ISH przeprowadzono przy użyciu sondy RNA SARS-CoV-2 wyprodukowanej przez Advanced Cellular Diagnostics (nr kat. 848568; Newark, CA, USA). Kontrolę pozytywną dla tych dwóch metod wykonano przy użyciu utrwalonych w formalinie komórek VERO zakażonych SARS-CoV-2, uzyskanych z University of Chicago Human Tissue Resource Laboratory (HTRL; Lemont, IL, USA). Zawiesinę utrwalonych w formalinie komórek VERO zakażonych COVID-19 użyto do utworzenia bloku komórek, który podzielono na szkiełka 5 μm, a następnie przetestowano każdym z dostępnych w handlu odczynników. Oprócz tych komercyjnych sposobów wykrywania wirusów,

Ilościowe IHC zapalenia

Oznaczenie ilościowe wybarwień IHC przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Philips Digital Pathology (DPS; Amsterdam, Holandia), QuPath [ 30] i GraphPad Prism (San Diego, Kalifornia, USA). Krótko mówiąc, slajdy zostały najpierw zeskanowane do Philips DPS i połączone geograficznie. Szkiełka barwione markerami CD3, CD8 i CD20 IHC oceniano przy różnych powiększeniach (CD4 wyprowadzono matematycznie na podstawie proporcji komórek T CD8: CD3) i zapisano reprezentatywne zrzuty ekranu. Te połączone geograficznie zrzuty ekranu zostały następnie ocenione za pomocą QuPath. Obszary zainteresowania (ROI) zdefiniowano jako obszary zmian patologicznych ze zwiększonym wybarwieniem IHC w miąższu płuc. W tej analizie nie uwzględniono węzłów chłonnych i widocznej tkanki węzłowej. Obszary ROI zostały narysowane i zduplikowane, aby dopasować je do innych odpowiednich plam. Końcowy wynik był taki, że dokładnie te same obszary były oceniane dla każdej plamy. Dodatni obszar piksela w każdym ROI został wykorzystany do określenia stosunku komórek CD8: CD3, i obliczyć szacunkowe stosunki CD4: CD8. Otrzymane dane uśredniono zarówno na podstawie wyników na pacjenta, jak i we wszystkich powtórzeniach dla każdego barwienia. Średnie i rozkłady wyników zostały wykreślone i zbadane statystycznie za pomocą GraphPad Prism. Statystyki przeprowadzono przy użyciu niesparowanych Studentówt – testy z poprawką Welcha (dla porównania średnich z nierównomiernymi rozkładami). Wyniki p <0,05 uznano za istotne statystycznie.

Wyniki

Informacje kliniczne dotyczące przypadków COVID-pozytywnych

Istotne informacje kliniczne i wybrane badania laboratoryjne pacjentów z COVID-19 podsumowano w materiale uzupełniającym, Tabela S1. Wszyscy pacjenci zostali przebadani na obecność COVID-19 za pomocą wymazu z nosa przed śmiercią i wszyscy byli pozytywni. Średni wiek pacjentów wynosił 65 lat, a większość przypadków stanowiły kobiety (56%). Jedenastu z 16 pacjentów było Afroamerykanami (69%), 3 pacjentów było Latynosami (19%), a 2 pacjentów było rasy białej (13%). Czternastu z 16 pacjentów (88%) miało objawy sercowo-płucne, a 15 pacjentów (94%) miało nieprawidłowe obrazowanie klatki piersiowej przy przyjęciu. Średnia długość przyjęć wynosiła 15,3 dnia (zakres 2–59), a 11 z 16 (69%) pacjentów było intubowanych i wentylowanych mechanicznie. U dziewięciu z 16 pacjentów (56%) wykonano plwocinę lub aspirację dotchawiczą podczas przyjęcia, a 4 z tych 9 (44%) wykazało wzrost istotnych patogenów. Warto zauważyć, że D-dimery zostały wylosowane na 15 z 16 (94%) pacjentów z COVID-19, a wszystkie z 15 D-dimerów były podwyższone, przy czym 8 z 15 (53%) to> 20. Troponinę o wysokiej czułości pobrano w 14 z 16 przypadków, przy czym 9 z 14 (64%) wykazało pewien stopień podwyższenia, a 5 z 14 (36%) znaczące podwyższenie. Ośmiu pacjentów zostało ponownie przebadanych pod kątem SARS-CoV-2 za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy wymazu z nosogardła (PCR) przed rozpoczęciem sekcji i wszyscy, z wyjątkiem jednego, byli nadal dodatni. Pojedynczy pacjent, który przed autopsją dał wynik negatywny, przebywał w szpitalu przez dłuższy czas z ponad miesięczną przerwą między wstępnymi badaniami a sekcją.

Informacje kliniczne dotyczące przypadków zakażenia wirusem grypy

Sześć reprezentatywnych śmiertelnych przypadków grypy sezonowej i sześć śmiertelnych przypadków grypy pandemicznej zostało pobranych z archiwów naszej instytucji w celu porównania z przypadkami COVID-19. Wszystkie uwzględnione przypadki zostały zatwierdzone do sekcji zwłok przez odpowiedniego przedstawiciela (przedstawicieli) pacjentów, a wszystkie badania zostały zatwierdzone przez IRB naszej instytucji na podstawie protokołu Research on Decedents. Przypadki grypy sezonowej obejmowały lata 2015–2018, a tym samym reprezentowały heterogenne szczepy grypy. Sześć przypadków autopsji grypy pandemicznej pochodziło z czwartej fali grypy hiszpańskiej i zostało wykonanych zimą 1920 r. Bloki nie były dostępne dla przypadków pandemii grypy, dlatego ocena ograniczała się do histomorfologii. Wiele ukierunkowanych procedur laboratoryjnych przeprowadzonych na wszystkich pacjentach z COVID-19 nie zostało wykonanych na pacjentach z grypą.S2 (należy zwrócić uwagę, że informacje kliniczne dotyczące pacjentów z pandemią grypy były poważnie ograniczone ze względu na brak danych i brak nowoczesnych platform do badań laboratoryjnych). Średni wiek pacjentów był niższy niż w przypadku pacjentów z COVID-19, przy czym pacjenci z grypą sezonową mieli średnio 46 lat, a pacjenci z pandemią grypy mieli średnio 37 lat (w porównaniu z 65 latami w przypadku COVID-19). Średnia długość przyjęć była również krótsza w przypadku pacjentów z grypą sezonową (3,5 wobec 15,3 dnia w przypadku COVID-19). Trzech pacjentów z grypą sezonową miało jednocześnie zakażenia, jeden wirusowy (ludzki metapneumowirus) i dwa bakteryjne (oba wrażliwe na metycylinę Staphylococcus aureus). D-dimery pobrano od trzech z sześciu (50%) pacjentów z grypą sezonową, a wszyscy trzej mieli> 20. Jeden z pacjentów z grypą sezonową, u których nie stwierdzono wyniku D-dimerów, był aktywnie leczony z powodu zatorowości płucnej przez kroplówkę heparyny. Zatem łącznie czterech z sześciu (67%) pacjentów z grypą miało albo wskaźniki laboratoryjne, albo kliniczne objawy zakrzepicy. Testy troponiny przeprowadzono na pięciu z sześciu pacjentów z grypą sezonową, przy czym trzech z pięciu (60%) wykazało pewien stopień podwyższenia, a jeden z pięciu (20%) wykazał znaczący wzrost.

Główne wyniki sekcji zwłok COVID-19

Płuca były rażąco nieprawidłowe w prawie wszystkich przypadkach COVID-19 (ryc. 1A i materiał uzupełniający, tabela S3). Najczęstszym objawem brutto była konsolidacja, przy czym 7 z 16 (44%) przypadków wykazywało konsolidację rozproszoną, a 2 przypadki (13%) wykazywały konsolidację ogniskową. Inne dość częste objawy to krwotoczny miąższ (obecny u 3/16, 18%) i obrzęk (obecny u 2/16, 12%). Zwłóknienie występowało w jednym przypadku (6%), a w jednym przypadku stwierdzono wyniki zgodne z rakiem przerzutowym. Tylko jeden przypadek (przypadek 9) nie wykazał istotnej konsolidacji ani krwotoku, ale w tym przypadku oba płuca nadal były ciężkie w porównaniu z grupą kontrolną dobraną wiekowo. Wszystkie masy płuc były nieprawidłowe, ze średnią wagą 841 g po prawej stronie i 727 g po lewej stronie.

wizerunek

Ryc.1

Reprezentatywne ogólne i mikroskopowe wyniki sekcji zwłok COVID-19. (A) Widmo reprezentatywnych dużych zmian, w tym rozproszonej konsolidacji i zmiennych ilości krwotoków. (B, C) DAD (odpowiednio powiększenie × 10 i × 100). (D) Śródmiąższowe naczynia włosowate z zapaleniem (x 400) i odwarstwieniem pneumocytów pęcherzykowych. (E) Krwotok (powiększenie × 10). (F) Zakrzepica (powiększenie × 10). (G) Zawał (powiększenie × 10). (H) Reaktywne, odłączone pneumocyty (powiększenie x 200). (I) Nałożone bakteryjne zapalenie płuc (powiększenie × 100). Wszystkie powiększenia przedstawiają całkowite powiększenie.

W 16 badanych przypadkach stwierdzono szereg zmian histologicznych w płucach (ryc. 1B – I i materiał uzupełniający, tabela S4 ). DAD występowało w 12 z 16 (75%) przypadków i zostało przedstawione jako spektrum od wczesnego do organizującego się DAD. Organizujące się skrzepliny zidentyfikowano w 6 z 16 (38%) przypadków, a zawał wtórny do zakrzepicy występował w 4 z 16 (25%) przypadków. W kilku przypadkach stwierdzono śródmiąższowe zapalenie naczyń włosowatych pęcherzyków płucnych ( ryc.1D). Nałożone zakażenia występowały w 9 z 16 (56%) przypadków, z których najczęstszym było bakteryjne zapalenie płuc (6/16 przypadków, 38%) i zachłystowe zapalenie płuc (3/16 przypadków, 19%). Rozproszone mikroskopijne skrzepliny zidentyfikowano w naczyniach włosowatych płuc w 10 z 16 (63%) przypadków, a dziewięć z tych przypadków oceniono za pomocą barwienia immunologicznego CD61, które potwierdziło, że zakrzepy były bogate w płytki krwi.

Znacznie reaktywne pneumocyty były obecne w 13 z 16 (81%) przypadków (ryc. 1D, H ). Cytologicznie, komórki te zostały powiększone wakuolowaną, amfifilową cytoplazmą i wykazywały zmiennie duże jąderka z otwartą do pęcherzykowej chromatyną (ryc. 1D ). Czasami komórki te były wielojądrowe i występowały jako liniowe paski unoszące się w przestrzeniach pęcherzykowych. Komórki te pojawiły się morfologicznie podobne do wcześniej określonych zmian histologicznych, zarówno w przypadku zakażeń SARS, grypa [ 31 – 34 ]. Oś czasu zmian histopatologicznych obserwowanych w płucach na różnych okresach przyjęć przedstawiono w materiale uzupełniającym, Tabela S5 .

W żadnym z serc, nerek, wątroby, śledziony ani węzłów chłonnych COVID-19 nie zidentyfikowano żadnych specyficznych dla choroby zmian. Szczegółowe mikroskopowe opisy tych narządów można znaleźć w materiale uzupełniającym, Tabela S4. Krótko mówiąc, najczęstszymi objawami histologicznymi związanymi z sercem były przerost miocytów i zwłóknienie śródmiąższowe, z których oba występowały w 3 z 16 przypadków (19%). Mikroangiopatię zakrzepową stwierdzono w 5 z 15 nerek (33%), a ostre uszkodzenie kanalików / martwicę w 4 przypadkach (27%). Ponadto odlewy zasadochłonne były obecne w 5 z 15 przypadków (33%), co może być związane z lekami. Inne zmiany dotyczące nerek najczęściej korelowały z chorobami współistniejącymi, takimi jak cukrzyca (5/15 przypadków, 33%) i nadciśnienie / miażdżyca tętnic (4/15 przypadków, 27%). W wątrobach stwierdzono szereg zmian histologicznych, które były związane z podstawowymi stanami pacjenta, w tym występowanie minimalnego do łagodnego stłuszczenia makropęcherzykowego w 9 z 15 przypadków (60%). Prawie wszystkie śledziony wykazywały ubytek miazgi białej i przekrwienie zatok, przy niewielkiej liczbie (3/15, 20%) wykazano zwiększoną hemofagocytozę w zatokach zatokowych. Znaczący odsetek przypadków (11/16 lub 69%) wykazywał zubożone pęcherzyki ze zmniejszonym tworzeniem się centrum rozmnażania wraz z ekspansją zatok przez histiocyty (dodatnie w kierunku CD68 i CD163, bez wybarwienia CD20 i CD3) w chłonce wnękowej i okołooskrzelowej węzły. Pięć z 16 węzłów chłonnych (31%) wykazywało istotnie zwiększoną hemofagocytozę, a 2 (13%) wykazywało również niedrożność małych naczyń krwionośnych przez skrzepliny bogatopłytkowe (ocena CD61). Znaczący odsetek przypadków (11/16 lub 69%) wykazywał zubożone pęcherzyki ze zmniejszonym tworzeniem się centrum rozmnażania wraz z ekspansją zatok przez histiocyty (dodatnie w kierunku CD68 i CD163, bez wybarwienia CD20 i CD3) w chłonce wnękowej i okołooskrzelowej węzły. Pięć z 16 węzłów chłonnych (31%) wykazywało istotnie zwiększoną hemofagocytozę, a 2 (13%) wykazywało również niedrożność małych naczyń krwionośnych przez skrzepliny bogatopłytkowe (ocena CD61). Znaczący odsetek przypadków (11/16 lub 69%) wykazywał zubożone pęcherzyki ze zmniejszonym tworzeniem się centrum rozmnażania wraz z ekspansją zatok przez histiocyty (dodatnie w kierunku CD68 i CD163, bez wybarwienia CD20 i CD3) w chłonce wnękowej i okołooskrzelowej węzły. Pięć z 16 węzłów chłonnych (31%) wykazywało istotnie zwiększoną hemofagocytozę, a 2 (13%) wykazywało również niedrożność małych naczyń krwionośnych przez skrzepliny bogatopłytkowe (ocena CD61).

Wykrywanie wirusów metodami pomocniczymi

Wszystkie komercyjne odczynniki testowane w naszym badaniu zareagowały odpowiednio z naszym blokiem komórek VERO zakażonych COVID-19 (Ryc. 2A – C ). Przeciwciało monoklonalne firmy Thermo-Fisher Scientific wykazało przekonujące barwienie pojedynczych komórek w kilku przypadkach; jednakże dystrybucja wirusa wydawała się niejednolita w skrawkach tkanek. Wzorce barwienia między IHC i ISH były w dużej mierze zgodne (ryc. 2D ). Co ciekawe, zakażone komórki były bardziej obfite na obszarach bez znaczących zmian patologicznych (Rysunek 2E, F). Zarówno IHC, jak i ISH wykazały, że podgrupa reaktywnych, pojawiających się pneumocytów, była pozytywna dla SARS-CoV-2. Jednak zarówno zakażone, jak i niezainfekowane reaktywne pneumocyty wykazywały wakuolację cytoplazmatyczną, amfifilową cytoplazmę i sporadyczne reaktywne zmiany jądrowe, co uniemożliwia odróżnienie komórek zakażonych od niezainfekowanych za pomocą samej mikroskopii świetlnej (ryc. 3A, B ).

wizerunek

Rysunek 2

Ocena IHC i ISH w celu identyfikacji komórek zakażonych SARS-CoV-2. (A – C) Blok komórek kontroli dodatniej wykonany z komórek VERO zakażonych SARS-CoV-2, z hematoksyliną i eozyną (powiększenie A, x 200), IHC przy użyciu przeciwciała monoklonalnego Thermo-Fisher Scientific (B, powiększenie x 200), i RNAScope ISH (C, powiększenie x 200). (D) Analiza sparowanych regionów pokazująca rozmieszczenie komórek zakażonych wirusem jest porównywalna między IHC (górny panel) i ISH (dolny panel) (powiększenie x 100). (E) Analiza sparowanych regionów pokazująca, że ​​zmiany histopatologiczne związane z COVID-19 (górny panel) mogą być negatywne dla komórek zakażonych wirusem według IHC (dolne panele) (powiększenie × 20). (F) Analiza sparowanych regionów pokazująca stosunkowo mdłe obszary (górny panel) może mieć wiele zakażonych wirusem komórek według IHC (dolny panel) (F, powiększenie × 20; wstawka × powiększenie 200).
wizerunek

Rycina 3

Nieswoista cytomorfologia komórek zakażonych SARS-CoV-2 w tkankach ludzkich i wykazanie reaktywności krzyżowej z odczynnikami IHC. (A) Skrawki barwione hematoksyliną i eozyną (H&E) (po lewej) ze sparowanym IHC (po prawej) komórek zakażonych wirusem wykazujących wakuolizację cytoplazmatyczną i reaktywne zmiany jądrowe w zakażonych komórkach (powiększenie x 600). Tkanka wypreparowana z tego IHC-dodatniego regionu bloku parafiny wykazuje kandydatów na cząstki podobne do wirionów (wstawka, EM, x 80 000). (B) IHC grupy komórek z tego samego przypadku (lewy H&E, prawy IHC) z identycznymi cechami cytomorfologicznymi, które są negatywne dla wirusa w IHC (powiększenie x 400). (C – E) Wykazanie nieswoistego barwienia bakterii metodą IHC w przypadku martwiczego bakteryjnego zapalenia płuc i grypy od 2015 r. (C) H & Obraz wybarwiony metodą E obszaru barwienia dodatniego (powiększenie × 100). (D) Pozytywne barwienie bakterii i makrofagów obciążonych bakteriami metodą IHC (powiększenie × 200). (E) Ujemne barwienie ISH tego samego regionu (powiększenie x 200). Wszystkie powiększenia przedstawiają całkowite powiększenie.

Przypadki niespecyficznego barwienia odnotowano w przypadku przeciwciała IHC stosowanego w naszym badaniu. Dwa przypadki grypy z 2015 r. Z nałożoną infekcją bakteryjną silnie i przekonująco wybarwiły się pod kątem SARS-CoV-2 (ryc. 3C – E ). Zastosowanie prostych szczególnych zabrudzeń, takich jak tkanka Grama i błękit pruski plam udało się rozwiązać ten problem z perspektywy czasu i ISH nie reaguje krzyżowo z bakteriami w tej samej części tkanki (figura 3E). Ślepe pobieranie próbek tkanki płucnej pod kątem EM nie było w stanie wykazać przekonujących struktur wirionów w 10 próbkowanych przypadkach (co stanowiło około 25 oddzielnych siatek EM). Użycie IHC i ISH do bezpośredniego pobierania próbek tkanki zatopionej w parafinie pod kątem EM ujawniło sporadyczne cząsteczki „podobne do wirionów” w komórkach pod względem morfologicznym zgodnym pod względem lokalizacji i wyglądu z komórkami zakażonymi wirusem (Ryc. 3A , wstawka). Cząstki te wykazywały rozmiar od 80 do 120 nm i zawierały wewnętrzne struktury przypominające kropki morfologicznie przypominające wiriony [ 35]. Jednakże, ponieważ opis ultrastruktury wirionu jest nieco niespecyficzny, a we wszystkich ocenianych przez nas ślepych sekcjach zidentyfikowano liczne imitacje wirionów, wstrzymujemy się od ostatecznego stwierdzenia, że ​​struktury zidentyfikowane nawet w tych docelowych obszarach reprezentują prawdziwe wiriony.

Patologiczne porównanie COVID-19 ze śmiertelną grypą

Po raz pierwszy przeanalizowano cechy histologiczne zakażenia grypą, aby ułatwić porównanie z COVID-19 [ 33 , 34 ]. Grypa i COVID-19 w znacznym stopniu się pokrywały pod względem wyników histologicznych w płucach (ryc. 4 i 5 ). DAD był częstym objawem grypy, obecnym w 7 z 12 przypadków (58%), podobnie jak krwotok (8/12, 67%) (ryc. 4 i 5 oraz materiał uzupełniający, tabela S2 ). Wystąpiło pozorne wzbogacenie krwotoku w przypadkach grypy (67% w porównaniu z 31%), a różnica ta dążyła do istotności ( p= 0,07, chi-kwadrat). Nałożone procesy zakaźne wystąpiły również w 10 z 12 (83%) przypadków, w tym we wszystkich przypadkach pandemii grypy. Reaktywne pneumocyty zidentyfikowano w kilku sekcjach dotyczących zarówno przypadków grypy sezonowej, jak i pandemicznej (ryc. 4B, C, F i 5E ). Komórki te miały podobne cechy do COVID-19, takie jak wakuolacja cytoplazmatyczna, otwarta chromatyna i widoczne jąderka i były mniej więcej nie do odróżnienia od tych obserwowanych w COVID-19. Barwienie CD61 ujawniło obecność zakrzepów bogatopłytkowych w przypadkach grypy, ale ogólna liczebność skrzeplin płytek była istotnie mniejsza w przypadku grypy niż w przypadku zakażenia COVID-19, chociaż wyniki te są omówione w innym miejscu [ 36 ].

wizerunek

Ryc.4

Reprezentatywne wyniki histologiczne w przypadkach śmiertelnej grypy sezonowej pobrane z próbek archiwalnych. (A) DAD histologicznie nie do odróżnienia od COVID-19 (powiększenie × 50). (B) Śródmiąższowe zapalenie z reaktywnymi, oddzielonymi pneumocytami (powiększenie x 400). (C) Reaktywne, oderwane pneumocyty na tle krwotoku pęcherzykowego (powiększenie x 200). (D) Zakrzepica (powiększenie × 50). (E) Zawał (powiększenie × 50). (F) Nałożone bakteryjne zapalenie płuc (powiększenie x 200; należy zwrócić uwagę na obecność widocznych i czasami wielojądrowych pneumocytów).
wizerunek

Rycina 5

Reprezentatywne wyniki histologiczne w przypadkach śmiertelnej grypy pandemicznej pobrane z próbek archiwalnych. (A, B) DAD (powiększenie × 100). (C) DAD, obrzęk i krwotok w sąsiedztwie dróg oddechowych zawierających śluz zapalny (powiększenie x 100). (D) Śródmiąższowe zapalenie naczyń włosowatych (powiększenie x 200). (E) Reaktywne pneumocyty wykazujące jąderka i wakuole cytoplazmatyczne, podobne do tych obserwowanych w grypie sezonowej i COVID-19 (powiększenie x 400). (F) Nałożone bakteryjne zapalenie płuc (powiększenie × 100).

Podobnie jak w przypadku zakażenia COVID-19, niejednorodne śródmiąższowe komórki T CD3 + były dominującymi komórkami zapalnymi w grypie sezonowej i stwierdzono, że są one mieszanką CD8 i CD4 (Rysunek 6A – D ), przy czym zidentyfikowano również rzadkie komórki B CD20 +. Ilościowe IHC przeprowadzono przy użyciu sześciu przypadków grypy sezonowej i sześciu reprezentatywnych przypadków COVID-19 z typowymi wynikami. Różnica w średnich stosunkach CD4: CD8 nie była istotna (Rysunek 6C – F), chociaż wydaje się, że COVID-19 wykazuje ogólną tendencję do wyższych wskaźników CD4: CD8 niż grypa. Warto zauważyć, że stosunek podzbiorów komórek T był dość zmienny w różnych obszarach ROI, nawet u tego samego pacjenta zarówno w przypadku COVID-19, jak i grypy. Wcześniej zgłaszano występowanie zależnego przestrzennie wzorca rekrutacji w różnych miejscach w płucach w przypadku zakażenia grypą [ 34], ale według naszej wiedzy takie badania nie zostały jeszcze przeprowadzone dla zakażeń koronawirusem. W trzech z sześciu przypadków grypy pobrano próbki z węzłów chłonnych i we wszystkich wykazano zubożone pęcherzyki z pewnym składnikiem histiocytozy zatokowej. W węzłach chłonnych kontrolnych po resekcji raka wykazano również stopień histiocytozy zatok, która często wiązała się z antrakozą, częstą obserwacją w węzłach chłonnych piersiowych mieszkańców miast w ogóle. W związku z tym znaczenie ustaleń dotyczących węzłów chłonnych pacjentów z COVID-19 (tj. Zubożenie i histiocytoza zatok) jest wątpliwe i ogólnie nie było uderzających różnic między grupami.

wizerunek

Rycina 6

Ilościowa ocena stanu zapalnego w COVID-19 i grypie sezonowej. Reprezentatywne sparowane regiony przedstawiające barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) wraz z immunobarwieniami CD20, CD8 i CD3 (zgodnie z ruchem wskazówek zegara od H&E) dla (A) grypy i (B) COVID-19. Dystrybucja komórek T i względna liczebność komórek CD8-dodatnich w stosunku do CD3 jest porównywalna. (C, D) Reprezentatywna analiza ROI dla plam immunologicznych CD3 i CD8 w przypadku (C) śmiertelnej grypy i (D) COVID-19. (E, F) Graficzne przedstawienie indywidualnych stosunków CD4: CD8 na ROI (E) i skumulowanych stosunków CD4: CD8 na pacjenta (F). Należy zauważyć, że nie ma znaczącej różnicy w stosunkach CD4: CD8 między COVID-19 a grypą, chociaż istnieje trend w kierunku wyższego CD4: CD8 dla COVID-19. Na rycinie 1E poszczególni pacjenci są identyfikowani na podstawie unikalnego kształtu na wykresie dla każdej choroby.

Dyskusja

W naszej porównawczej serii przypadków stwierdziliśmy, że większość cech histologicznych opisanych dla COVID-19 wystąpiła również w przypadkach grypy sezonowej i pandemicznej. Ponadto w naszym badaniu zaobserwowano duży stopień klinicznego nakładania się pacjentów z COVID-19 i grypą, w szczególności zapotrzebowanie na wentylację mechaniczną w znacznej podgrupie obu grup oraz obecność nadkażeń bakteryjnych. Te podobieństwa mogą oczywiście przesłaniać bardziej subtelne zmiany specyficzne dla choroby, ale ważnym wnioskiem z naszych danych jest to, że te niespecyficzne powikłania występują z podobną częstością zarówno w przypadku ciężkiego COVID-19, jak i grypy, co wskazuje na przynajmniej pewien stereotypowy postęp kliniczny w ciężkich przypadkach obu. choroby. Jedną z istotnych różnic klinicznych między grupami był średni wiek,

Jeśli chodzi o cechy histologiczne, przypadki grypy wykazywały zmiany krwotoczne częściej niż COVID-19, ale był to raczej trend niż statystycznie istotna różnica w naszym zbiorze danych. Chociaż zakrzepica została opisana jako nieco wyjątkowa cecha zakażenia COVID-19 w porównaniu z innymi infekcjami, w naszym badaniu skrzepliny nie były szczególnie specyficzne dla pacjentów z COVID-19, ponieważ podwyższone D-dimery stwierdzono u większości obu COVID-19 badani pacjenci z grypą sezonową. Jak wspomniano powyżej, we wcześniejszym raporcie wykazano, że przypadki COVID-19 wykazują znacznie wyższy stopień bogatych w CD61 mikrozakrzepów w naczyniach płucnych w porównaniu z grypą [ 36]. To samo badanie wykazało również, że mikrozakrzepki są widoczne w całym spektrum zakaźnych i niezakaźnych przyczyn DAD, a w tym badaniu było kilka innych warunków, które spowodowały więcej mikrozakrzepów niż COVID-19. Mikrozakrzepowe i zakrzepica w ogóle są rozpoznanymi składnikami zarówno ciężkich infekcji wirusowych, jak i DAD [ 30 , 36 ], a ponieważ przypadki autopsji w naturalny sposób odzwierciedlają cięższe przypadki infekcji, możliwe jest, że takie badania w naturalny sposób wzbogacają pacjentów z ciężkimi powikłaniami zakrzepowymi. Ogólnie rzecz biorąc, zmiany koagulopatyczne obserwowane podczas sekcji zwłok COVID-19 wydają się nie być całkowicie specyficzne dla tej choroby w porównaniu z innymi ciężkimi chorobami zakaźnymi [ 37 , 38 ].

Chociaż różnice w nacieku immunologicznym (tj. Średnim stosunku CD8: CD4) występującym w płucach pacjentów z COVID-19 nie różniły się istotnie od przypadków grypy w naszym badaniu, istniała tendencja do wyższych wskaźników CD4: CD8 w COVID-19, ustalenie, które zostało szczegółowo opisane wcześniej [ 39 ]. Ograniczona liczba przypadków ocenianych tą metodą wraz z brakiem możliwości kontrolowania zmienności między pacjentami mogą być czynnikami utrudniającymi tego rodzaju analizę. Ogólnie rzecz biorąc, skład nacieku zapalnego zasługuje na dalsze badania za pomocą bardziej czułych i specyficznych metod w bardziej kontrolowanych warunkach, takich jak te wykonywane wcześniej w przypadku grypy [ 34 ]. Biorąc pod uwagę, że podstawową funkcją limfocytów T CD4 jest produkcja cytokin i regulacja odporności [ 40], ich pozorne wzbogacenie w COVID-19 w stosunku do zakażenia grypą może być związane z istotnymi różnicami patofizjologicznymi między tymi dwoma zakażeniami i powinno być dalej badane. W obecnym stanie nasze dane dotyczące nacieku immunologicznego pokazują jedynie, że typowanie limfocytów T lub innych leukocytów prawdopodobnie nie zapewni użyteczności diagnostycznej podczas sekcji zwłok.

Nasze kompleksowe podejście opierało się na wkładzie ekspertów-diagnostów z wielu różnych podgrup patologii dla wszystkich układów narządów ocenianych w naszej kohorcie COVID-19, co dodaje wiarygodności zarówno pozytywnym, jak i negatywnym wynikom we wszystkich ocenianych układach narządów. Zarówno nasze populacje pacjentów z COVID-19, jak i grypą sezonową były przeważnie Afroamerykanami i, zgodnie z naszą wiedzą, nie przeprowadzono żadnych badań porównujących patologię i dane laboratoryjne COVID-19 i grypy w populacjach głównie afroamerykańskich. Ponadto, wcześniejsze badania autopsyjne afroamerykańskich pacjentów z COVID-19 miały ograniczony charakter [ 8 ], mimo że Afroamerykanie ponoszą nieproporcjonalny ciężar zachorowalności podczas pandemii [ 41].]. Na podstawie naszych danych patologiczne zmiany u Afroamerykanów wydają się być mniej więcej identyczne z tymi obserwowanymi u innych ras, bez żadnych specyficznych zmian histomorfologicznych widocznych w naszej serii. Nieproporcjonalne obciążenie śmiertelnością obserwowane we wcześniejszym badaniu może zatem mieć charakter wieloczynnikowy [ 41 ] lub przynajmniej wynika z czynników niewidocznych w rutynowej analizie histopatologicznej. Wreszcie, włączenie kilku przypadków grypy pandemicznej do analizy histologicznej z czwartej fali grypy hiszpańskiej jest również nowością i stanowi ważne porównanie, biorąc pod uwagę pandemiczny charakter zarówno COVID-19, jak i grypy hiszpańskiej. Podczas gdy wyniki sekcji zwłok w przypadku grypy hiszpańskiej i grypy były wcześniej porównywane z COVID-19 [ 42], zgodnie z naszą wiedzą, jako pierwsi uwzględniliśmy wyniki badań histologicznych z grypy pandemicznej, zamiast polegać na wynikach zgłoszonych w historycznych dokumentach z sekcji zwłok. Wreszcie, nasza wszechstronna analiza została połączona z krytyczną oceną trzech pomocniczych metod wykrywania wirusów SARS-CoV-2. Chociaż nasze dane pokazują, że techniki pomocnicze są w stanie zidentyfikować komórki zakażone wirusem i mogą być przydatne w ustalaniu diagnozy zakażenia COVID-19 (podobnie jak we wcześniejszych raportach [ 32 , 43]), istnieją wyraźne pułapki związane z tymi metodami, które nie zostały uwydatnione we wcześniejszych badaniach. Większość wybarwień wirusów kierowanych przez IHC i ISH wystąpiła na obszarach o stosunkowo minimalnych zmianach patologicznych, a zatem celowanie tylko w obszary aktywnego uszkodzenia płuc może przeoczyć komórki zakażone wirusem. Ponadto w przypadkach nałożonych infekcji bakteryjnych (które występowały u większości pacjentów zarówno z COVID-19, jak i grypą), może wystąpić reaktywność krzyżowa z niektórymi gatunkami bakterii przy użyciu niektórych odczynników IHC, co może prowadzić do fałszywie dodatnich wyników podczas stosowania Tylko IHC. ISH może być użytecznym mechanizmem rozwiązywania dylematów diagnostycznych, ale ta metoda wymaga specjalistycznej wiedzy laboratoryjnej i specjalnych odczynników, które mogą nie być tak szeroko dostępne, jak te stosowane w IHC. W naszym badaniu z łatwością zastosowano specjalne barwienia, takie jak barwienie Grama i błękit pruski, aby odróżnić barwienie niespecyficzne od barwienia rzeczywistego obserwowanego w przypadku IHC. My, podobnie jak inni [35 ], stanowczo ostrzegają przed stosowaniem EM do wykrywania wirusów poprzez ślepe lub ukierunkowane pobieranie próbek utrwalonej tkanki ze względu na dużą liczbę naśladowców. Ogólnie uważamy, opierając się na naszych wstępnych doświadczeniach z tymi pomocniczymi metodami, że korelacja między badaniami klinicznymi uzyskanymi przed śmiercią (w szczególności PCR nosogardzieli i / lub serologicznymi testami przeciwciał) w połączeniu z wynikami histologicznymi może być wystarczająca do ustalenia rozpoznania u większości przypadków, nawet w przypadku braku tych dodatkowych metod. W przypadkach, w których utrzymuje się wysoki wskaźnik podejrzenia COVID-19, ale te metody pomocnicze i testy przedśmiertne pozostają negatywne, można by również zbadać inne metody nieocenione w naszym badaniu, takie jak ilościowy PCR [ 43 ].

Nasza zbiorcza praca wzbogaca rosnącą wiedzę na temat zmian patologicznych związanych z COVID-19 i odpowiednio kontekstualizuje patologiczne ustalenia obecne w zakażeniu COVID-19 z objawami obserwowanymi w przypadku śmiertelnych zakażeń grypą (zarówno w odmianach sezonowych, jak i pandemicznych). Wyniki pokazują, że większość zaobserwowanych zmian patologicznych nie jest specyficznych dla COVID-19, a zatem są zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, że wyniki patologiczne zarówno w przypadku COVID-19, jak i grypy są podobne i są zasadniczo nie do odróżnienia histomorfologicznie od innych przyczyn DAD [ 44 – 46]. Ostrzegamy, że naszych wyników nie należy interpretować jako sugestii, że grypa i COVID-19 są równoważne pod względem nasilenia klinicznego lub że nie wykazują krytycznych różnic patofizjologicznych. Pełna ocena patofizjologii tych dwóch odrębnych chorób wykraczała poza zakres naszego badania, które ograniczało się do porównania zarówno cech klinicznych, jak i histologicznych obserwowanych w przypadkach autopsji. Nasze badanie potwierdza tylko, że zmiany patologiczne i oszacowane wartości laboratoryjne w czasie sekcji wydają się być bardzo podobne we wszystkich śmiertelnych przypadkach ciężkiego COVID-19 i grypy. Opisane ustalenia są ogólnie zgodne z wynikami opublikowanymi niezależnie zarówno w odniesieniu do COVID-19, jak i grypy. Dlatego uważamy, że odkrycia mogą stanowić powszechną odpowiedź na ciężkie uszkodzenie płuc wywołane przez wirusy,

Podziękowanie

Autorzy są bardzo wdzięczni Gary’emu Randallowi i ciężko pracującym osobom z COVID-Research Core na University of Chicago za dostarczenie komórek VERO zakażonych SARS-CoV-2 do tkanki kontrolnej. Chcielibyśmy podziękować Terri Li, Ming Cheng i Can Gong z Human Tissue Resource Center (HTRC) na Uniwersytecie w Chicago za wykonanie SARS-CoV-2 IHC i ISH oraz Markowi Lingen z HTRC za jego spostrzeżenia związane z proces walidacji zarówno dla IHC, jak i ISH. Badanie zostało sfinansowane ze środków wewnętrznych Wydziału Patologii.

Oświadczenie autora

PM, PP, TK, ANH i JM opracowali koncepcję badania, przeprowadzili eksperymenty, przeanalizowali dane i napisali / zrecenzowali manuskrypt. HS, JV, AlS, JH, LA, AC i SG przeprowadzili eksperymenty, przeanalizowali dane i napisali / zrecenzowali części manuskryptu. JB przeprowadził eksperymenty. RG, DW, NS, AA i AnS przeanalizowali dane i przejrzeli artykuł.

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cjp2.220

6.00 avg. rating (99% score) - 2 votes
CZERWONE

Wyraź swoją opinię ! TO WAŻNE !!

Witryna wykorzystuje Akismet, aby ograniczyć spam. Dowiedz się więcej jak przetwarzane są dane komentarzy.

ODBLOKUJ TREŚCI I STREAM KLIKAJĄC W PONIŻSZY OBRAZEK PEŁNA INSTRUKCJA  + MATERIAŁ FILMOWY !! 

Holler Box

KORZYSTASZ Z OGRANICZONEGO CZASOWO DOSTĘPU !!

DALSZE KORZYSTANIE ZE STRONY MOŻLIWE PO URUCHOMIENIU DOSTĘPU PREMIUM 

 

STREAM PONIEDZIAŁEK , WTOREK, ŚRODA , CZWARTEK 21.00 - SOBOTA 20.00

ABY TA BLOKADA STRONY BYŁA DLA CIEBIE NIE WIDOCZNA ZAŁÓŻ KONTO I ZALOGUJ SIĘ INSTR. FILMOWA PONIŻEJ :-)

ODBLOKUJ TREŚCI I STREAM KLIKAJĄC W PONIŻSZY OBRAZEK PEŁNA INSTRUKCJA  + MATERIAŁ FILMOWY !! 

Holler Box
%d bloggers like this: